EMSA和DNA足迹法是研究蛋白质-DNA相互作用的经典方法。EMSA检测结合并测量亲和力，而足迹法鉴定结合蛋白接触的特定核苷酸。

电泳迁移率变动分析

EMSA（也称为凝胶迁移分析）基于以下观察：蛋白质-DNA复合物在天然聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比游离DNA慢，类似于琼脂糖凝胶电泳。含有假定结合位点的放射性或荧光标记的DNA探针与蛋白质提取物或纯化蛋白孵育。混合物通过天然凝胶电泳分离。游离DNA跑得更快，而蛋白质结合的DNA迁移到凝胶中更高的位置。

EMSA高度灵敏，可以检测复杂混合物中的相互作用。特异性通过与未标记的特异性和非特异性DNA竞争来证明。过量的未标记特异性DNA消除迁移带，而非特异性竞争者则不。超迁移分析使用针对结合蛋白的抗体进一步延缓复合物，确认蛋白质身份。

结合亲和力和化学计量

EMSA可以通过滴定蛋白质浓度和量化结合DNA的比例来测量结合亲和力。平衡解离常数从半最大结合时的蛋白质浓度确定。多个迁移带可以揭示不同的化学计量复合物或多个结合位点。当结合曲线呈S形而非双曲线时，可检测到协同结合。

探针设计

用于EMSA的DNA探针通常为20至40碱基对，包含结合位点。双链探针通过退火互补寡核苷酸并进行末端标记（使用放射性磷-32或荧光染料）制备。几百碱基对的较长探针可用于定位顺式调控区。生物素标记的探针配合化学发光检测（如Southern印迹中使用的）提供非放射性替代方案。

DNase I足迹法

DNase I足迹法鉴定由结合蛋白保护的特定核苷酸。一端标记的DNA片段与结合蛋白孵育，然后用DNase I部分消化。核酸酶随机切割未保护的DNA，但蛋白质结合区域免受切割。消化产物通过变性凝胶电泳与测序梯状条带一起分离。

保护模式表现为条带梯中的缺口，即足迹。足迹的边界以核苷酸分辨率定义蛋白质结合位点。超敏感位点（DNase I更频繁切割的位置）通常出现在足迹的边缘，指示蛋白质结合诱导的DNA弯曲。

羟基自由基足迹法

羟基自由基足迹法使用高度反应性的羟基自由基在每个位置切割DNA骨架，序列偏好很小。自由基通过使用铁-EDTA、抗坏血酸和过氧化氢的芬顿反应产生。由于自由基比DNase I小，羟基自由基足迹法提供更高的分辨率，检测单个核苷酸面上的接触。它特别适用于分析沿DNA螺旋的蛋白质-DNA相互作用的周期性。

体内方法

体内足迹法使用在活细胞中修饰DNA的试剂。硫酸二甲酯甲基化未被结合蛋白保护的鸟嘌呤残基。处理后，分离DNA，在甲基化位点切割，并通过连接介导的PCR分析。体内和体外模式的比较揭示了细胞中哪些结合位点被占据。染色质可及性分析如DNase-seq和ATAC-seq提供开放染色质的全基因组视图，但分辨率低于足迹法。

应用

EMSA用于确认预测的转录因子结合位点、表征突变结合位点、研究协同相互作用以及监测纯化过程中的结合活性。足迹法鉴定蛋白质识别的确切DNA序列并揭示结合诱导的构象变化。

局限性

EMSA需要相对稳定的复合物以在电泳中存活。快速解离的复合物可能检测不到。凝胶基质可以稳定弱相互作用，但也可能因笼蔽效应产生假象。两种技术都需要纯化的DNA探针，不适用于高通量分析。定量EMSA需要仔细控制探针比活性和检测线性。