琼脂糖凝胶电泳是一种基本的实验室技术，用于根据 DNA 片段的大小进行分离。当科学家需要在限制性消化、PCR 或纯化后分析 DNA 时，他们会使用凝胶电泳来可视化结果。虽然平板琼脂糖凝胶仍然是常规 DNA 分析的标准，但[毛细管凝胶电泳](/guides/capillary-gel- electrophoresis) (CGE) 提供了一种自动化、高通量的激光诱导荧光检测替代方案，广泛用于法医 DNA 分析和 DNA 测序。
琼脂糖凝胶电泳的工作原理
该技术依赖于这样一个事实：DNA 带负电，当置于电场中时，DNA 会向正极迁移。
- 制备凝胶
将琼脂糖粉末与 TAE 或 TBE 缓冲液（通常为 1× TAE 或 0.5× TBE）混合并加热直至溶解。将熔化的琼脂糖倒入铸模托盘中，插入梳子以形成孔。当它冷却时，它固化成多孔凝胶基质。
- 加载样品
DNA 样品与含有甘油的上样染料（使它们下沉）和示踪染料（以监测迁移）混合。将样品移入凝胶孔中。 DNA 梯子（已知大小的片段的混合物）被加载到第一个孔中作为大小参考。
- 电泳
在凝胶上施加电流。由于 DNA 带负电，片段通过凝胶向正极移动。较小的碎片可以轻松地穿过凝胶孔并快速移动，而较大的碎片移动速度较慢。随着时间的推移，碎片根据其大小分成不同的带。
- 可视化
电泳后，凝胶用 DNA 结合染料（例如溴化乙锭或 SYBR Safe）染色。当置于紫外线下时，染料会发出荧光，显示 DNA 带。通过比较条带与 DNA 梯子的位置，科学家可以确定每个片段的大小。
实用凝胶电泳实验方案
根据预期片段大小选择琼脂糖百分比：0.8-10 kb 为 0.7%，0.5-5 kb 为 1.0%，0.2-3 kb 为 1.5%，0.1-1 kb 为 2.0%。称取适量琼脂糖（例如，1% 凝胶为 1 g），并添加 100 mL 1× TAE 缓冲液。在微波炉中加热直至琼脂糖完全溶解 - 每 30 秒旋转一次以防止过热。冷却至 ~60°C，添加 5 µL GelGreen 或溴化乙锭 (10 mg/mL)，混合，然后倒入插入梳子的铸模托盘中。等待 20-30 分钟凝固。将凝胶放入装有 1× TAE 的电泳槽中。将 5 µL 每个 DNA 样品与 1 µL 6× 上样染料（含有甘油和溴酚蓝）混合。将整个体积装入孔中。在第一个和最后一个孔中加载 5 µL 1 kb Plus DNA 梯子。以 5–10 V/cm（以电极之间的距离测量）运行 — 对于 10 cm 凝胶，通常为 80–100 V。运行直至溴酚蓝染料前沿迁移大约三分之二的凝胶长度（30-60 分钟）。在紫外透照仪上观察（溴化乙锭为 302 nm，GelGreen 为 470 nm）并拍照。对于下游应用（凝胶提取），请使用长波长紫外线 (365 nm) 以最大限度地减少 DNA 损伤。
实际应用
PCR 扩增 1.5 kb 基因片段后，将 5 µL 产物在 1% 琼脂糖凝胶上与 1 kb 梯子一起进行电泳。 1.5 kb 处的明亮单条带证实成功扩增，没有引物二聚体或非特异性产物。对凝胶拍照，并在紫外线下切除条带以进行纯化和克隆。
