固定是组织保存的第一步也是最关键的一步。它停止细胞 decay，稳定大分子，并硬化组织以供后续处理和切片。每个下游技术——H&E染色、IHC、分子分析——的质量取决于充分和适当的固定。

固定的目标

固定的主要目标是防止自溶（细胞内酶的自消化）和腐败（细菌分解）；尽可能接近活体状态保存组织形态；硬化组织以便切割而不变形；稳定细胞成分（蛋白质、核酸、碳水化合物）以供染色；以及使细胞可被染料和抗体渗透。没有一种固定剂能最佳地实现所有目标——选择取决于预期的下游应用。

福尔马林化学原理

**10%中性缓冲福尔马林（NBF）**是组织病理学中的通用固定剂。商品福尔马林是37%的甲醛气体水溶液——10% NBF是1:10稀释液（3.7%甲醛）。中性缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，pH 7.0-7.2）可防止甲酸的形成（甲酸会引起酸 hematin 色素）并维持最佳交联条件。

甲醛通过在相邻氨基之间形成亚甲基桥（-CH2-）来交联蛋白质，特别是赖氨酸的ε-氨基和肽的酰胺基团。这创建了一个稳定组织结构的三维凝胶网络。交联是温度依赖的——在37°C的速率约为室温下的两倍。室温下常规固定需要小活检6-24小时，较大标本24-48小时。标准规则是每mm组织厚度1小时。

影响固定的因素

固定剂体积必须至少为组织体积的10-20倍。体积不足会在固定剂完全穿透前排空。组织厚度——切片厚度不应超过4-5 mm以保证充分穿透；较厚的切片中心固定不良。温度——较高温度加速固定，但在固定剂穿透前增加自溶；室温为常规使用的最佳选择。搅动——轻柔旋转改善固定剂在标本周围的循环。固定延迟——热缺血时间（从血管夹闭到标本切除的时间）和冷缺血时间（从切除到固定的时间）必须最小化。长时间冷缺血会降解RNA、蛋白质和磷蛋白（影响IHC，特别是ER和磷酸化特异性标志物）。

固定剂类型

交联（醛类）固定剂——甲醛、戊二醛（用于EM）、乙二醛（低毒性替代品）。戊二醛提供优越的超微结构保存，但穿透缓慢并引起更多交联，可能掩盖IHC抗原。

凝固性固定剂——乙醇、甲醇、丙酮。它们通过破坏水化层而非交联来沉淀蛋白质。它们保存酶活性和核酸，但引起更多收缩并快速硬化组织。酒精固定用于PCR和分子检测。

组合固定剂——Bouin液（苦味酸、甲醛、乙酸）提供优异的核细节，用于内分泌组织、睾丸活检和胃肠道活检。B5固定剂（氯化汞、甲醛）历史上用于淋巴结，但由于汞毒性现在很少使用。锌福尔马林是用于淋巴样抗原保存的无汞替代品。

非交联替代品——分子固定剂（PAXgene、HOPE）保存核酸和蛋白质用于分子分析，但形态学不如福尔马林理想。主要用于生物库和研究环境。

固定后处理

固定后，如果处理延迟，将标本转移到70%乙醇中储存。组织可以在70%乙醇中保存数周而无不良影响。在福尔马林中长时间储存（>72小时）会引起过度固定，增加抗原 masking 和DNA片段化。对于长期保存，福尔马林固定的组织可在24-48小时后转移到乙醇中。

质量控制

通过固定剂新鲜度（定期更换溶液）、固定时间（在申请单上记录）、外观（固定良好的组织坚硬且均匀苍白）和下游染色质量（固定不良表现为核细节差、苍白或H&E上的边缘效应）来监测固定。质量保证项目包括定期审查固定 adequacy 指标。