Die Fluoreszenzmikroskopie detektiert die Emission von Licht aus Fluorophoren bei Wellenlängen, die länger sind als die Anregungswellenlänge. Sie ermöglicht die hochspezifische Visualisierung mehrerer molekularer Ziele gleichzeitig im selben Gewebeschnitt. Die Konfokalmikroskopie erweitert die Fluoreszenzbildgebung durch Unterdrückung unscharfen Lichts und erzeugt scharfe optische Schnitte durch dicke Präparate.

Prinzipien der Fluoreszenz

Ein Fluorophor absorbiert Photonen bei einer spezifischen Anregungswellenlänge, wodurch Elektronen in einen höheren Energiezustand gehoben werden. Ein Fluoreszenzmikroskop verwendet eine Lichtquelle (Quecksilberbogenlampe, Xenon, LED oder Laser), einen Anregungsfilter, einen dichroitischen Spiegel und einen Emissionsfilter.

Fluorophore umfassen DAPI (DNA, blau), FITC (grün), TRITC (rot) und Alexa-Fluor-Farbstoffe. Immunfluoreszenz in formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe erfordert Antigendemaskierung. Autofluoreszenz von Lipofuszin, Elastin und Erythrozyten kann stören.

Konfokalmikroskopie

Die Konfokalmikroskopie verwendet eine Lochblende, die unscharfes Licht blockiert. Nur Licht aus der Fokusebene erreicht den Detektor, was einen optischen Schnitt von etwa 0,5-1,0 µm Dicke erzeugt.

Immunfluoreszenz ist die Standardmethode in der Nierenpathologie (IgA-Nephropathie, Lupusnephritis), Dermatopathologie (bullöse Erkrankungen) und Neuropathologie. Multiplex-Immunfluoreszenz ermöglicht die Detektion von 6-12 Markern auf einem einzigen Schnitt zur Charakterisierung der Tumormikroumgebung.

Einschränkungen

Fluorophore bleichen mit verlängerter Anregung aus. Autofluoreszenz ist besonders in formalinfixiertem Gewebe mit Lipofuszin problematisch. Die konfokale Bildgebung ist langsamer als die Weitfeldmikroskopie und erfordert spezielle Ausrüstung.