荧光显微镜检测荧光团在比激发波长更长的波长处发出的光。它能够在同一组织切片中同时高度特异地可视化多个分子靶标。共聚焦显微镜通过拒绝离焦光扩展了荧光成像，在厚标本中产生清晰的光学切片。

荧光原理

荧光团在特定激发波长处吸收光子，将电子提升到更高的能态。当电子返回基态时，它在更长（更低能量）的波长处发射光子——这种差异称为斯托克斯位移。荧光显微镜使用光源（汞弧灯、氙灯、LED或激光）、仅传输激发波长的激发滤光片、反射激发光并传输发射光的二色镜以及仅将发射波长传递到检测器的发射滤光片。

组织分析中常用的荧光团包括DAPI（DNA，蓝色）、FITC（绿色）、TRITC（红色）和Alexa Fluor染料（改进的亮度和光稳定性）。量子点是具有尺寸可调发射光谱的半导体纳米晶体，允许使用单个激发源进行多重分析。

组织中的免疫荧光

直接免疫荧光使用直接与荧光团偶联的一抗。间接免疫荧光使用未标记的一抗，通过荧光团偶联的二抗检测——每个一抗有多个二抗产生信号放大，提高了灵敏度。

福尔马林固定、石蜡包埋组织中的免疫荧光需要与显色IHC相同的抗原修复。冰冻切片通常产生更强的荧光，因为固定不会交联抗原。自发荧光来自脂褐素、弹性蛋白和红细胞，可能会干扰——使用光谱拆分或窄带滤光片可将其最小化。

**多重免疫荧光（mIF）**使用序贯染色循环、酪胺信号放大（TSA）或光谱成像在单个切片上检测6-12种标志物。这使得能够详细表征肿瘤微环境，包括免疫细胞亚群、检查点分子表达和空间关系。

共聚焦显微镜

共聚焦显微镜在发射光路中使用针孔光圈来阻挡离焦光。只有来自焦平面的光到达检测器，产生约0.5-1.0 µm厚的光学切片。通过扫描激光穿过标本并收集连续的光学切片（z-stacks），可以实现组织结构的三维重建。

**激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）**使用聚焦的激光束逐点扫描标本。它为多通道成像提供最高的分辨率和灵活性。转盘共聚焦显微镜使用带有数千个针孔的旋转盘，以更少的光漂白更快地捕获图像——适用于活细胞成像。

多光子显微镜

多光子（双光子）显微镜使用红外激光，其中两个较低能量的光子结合激发荧光团。这允许更深组织穿透（高达1 mm）、降低光毒性以及无需针孔的内置光学切片。用于活体动物中组织结构和细胞行为的活体成像。

在组织病理学中的应用

免疫荧光是肾脏病理学（IgA肾病、狼疮性肾炎）、皮肤病理学（水疱性疾病）和神经病理学（阿尔茨海默病：淀粉样蛋白-β和tau共定位）的标准检测方法。共聚焦显微镜能够详细分析三维组织结构。多重IF越来越多地用于免疫治疗研究，以绘制免疫细胞分布和PD-L1表达模式，用于预测性生物标志物开发。

局限性

荧光团在长时间激发下会发生光漂白（永久丧失荧光）——使用抗淬灭封片剂并最小化光暴露。自发荧光在含有脂褐素的福尔马林固定组织中是一个特殊问题（在衰老、心脏和肝组织中常见）——光谱拆分或光漂白预处理可能有所帮助。共聚焦成像比宽场慢，需要专用设备和培训。