Übersicht
Unter Genomassemblierung versteht man den rechnerischen Prozess der Rekonstruktion ganzer Genomsequenzen aus kurzen DNA-Fragmenten, die von Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattformen produziert werden. Da Sequenzierungsmaschinen jeweils nur Hunderte von Basenpaaren lesen, müssen Bioinformatiker Millionen oder Milliarden dieser Lesevorgänge zusammensetzen – ähnlich wie beim Lösen eines riesigen Puzzles. Die Genauigkeit eines zusammengesetzten Genoms wirkt sich direkt auf jede nachgelagerte Analyse aus, von der Genvorhersage bis zur vergleichenden Genomik. Moderne Assembler bewältigen die Komplexität sich wiederholender Regionen, Sequenzierungsfehler und variierender Abdeckungstiefen mithilfe ausgefeilter graphbasierter Algorithmen.
Schlüsselkonzepte
Es gibt zwei Hauptstrategien für die Genomassemblierung. De-novo-Assemblierung konstruiert ein Genom ohne vorherige Referenz und stützt sich dabei auf Overlap-Layout-Consensus (OLC) oder De-Bruijn-Graph-Ansätze, um Lesevorgänge in zusammenhängende Sequenzen, sogenannte Contigs, zusammenzuführen. Referenzgesteuerte Assemblierung ordnet Lesevorgänge einem bekannten Referenzgenom zu und setzt dann die nicht kartierten Teile zusammen, was besonders für Resequenzierungsprojekte nützlich ist. Zu den wichtigsten Qualitätskennzahlen gehören N50 (die Contig-Länge, in der 50 % der Baugruppe enthalten ist) und die Gesamtbaugruppengröße. Bei der Assembly-Validierung geht es häufig darum, bekannte Sequenzen abzugleichen oder Long-Read-Technologien zum Lückenschluss zu verwenden.
Anwendungen
Die Genomassemblierung ist für nahezu jede Genomikanwendung von grundlegender Bedeutung. Es ermöglicht die Entdeckung neuer Gene, die Identifizierung struktureller Varianten und die Charakterisierung nichtkodierender regulatorischer Elemente. In der Medizin ermöglichen zusammengesetzte Genome von Krankheitserregern eine schnelle Verfolgung von Ausbrüchen und die Erstellung von Antibiotikaresistenzprofilen. Die landwirtschaftliche Genomik ist auf hochwertige Assemblierungen angewiesen, um Merkmale von wirtschaftlicher Bedeutung abzubilden. Moderne Projekte kombinieren häufig Next-Generation-Sequencing-Daten mit langen Lesevorgängen und optischer Kartierung, um Assemblierungen auf Chromosomenebene zu erstellen, aufbauend auf klassischen DNA-Sequencing-Methoden. Die Montage unterstützt auch funktionale Studien wie das Zieldesign von CRISPR-Cas9, bei dem Vorhersagen außerhalb des Ziels von einer genauen Referenz abhängen.
Praktisches Protokoll
Beginnen Sie für die Illumina-basierte De-novo-Assemblierung eines Bakteriengenoms mit dem Qualitätstrimmen: „fastp -i R1.fastq -I R2.fastq -o trimmed_R1.fastq -O trimmed_R2.fastq -q 20 -l 50“. Zusammenstellen mit „SPAdes“ unter Verwendung mehrerer k-mer-Größen: „spades.py -1 trimmed_R1.fastq -2 trimmed_R2.fastq -o spades_output -k 21,33,55,77 –careful“. Das Flag „–careful“ reduziert Nichtübereinstimmungen und Indels durch die Ausführung von MismatchCorrector. Die Ausgabe umfasst „contigs.fasta“ und „scaffolds.fasta“. Für die Long-Read-Assemblierung mit Oxford Nanopore-Daten verwenden Sie „Flye“: „flye –nano-raw reads.fastq -o flye_out -t 8 -g 5m“, wobei „-g“ die geschätzte Genomgröße angibt. Für Hybridassemblys, die kurze und lange Lesevorgänge kombinieren, verwenden Sie „Unicycler“: „unicycler -1 short_R1.fastq -2 short_R2.fastq -l long_reads.fastq -o hybrid_assembly“. Bewerten Sie die Qualität der Assemblierung mit „QUAST“: „quast.py contigs.fasta -r reference.fasta -g genes.gff -o quast_output“. Zu den wichtigsten Kennzahlen gehören N50 (Contig-Länge, bei der 50 % der Assembly abgedeckt sind), die Gesamtgröße der Assembly, die Anzahl der Contigs, der Genomanteil (Anteil der abgedeckten Referenz) und die Anzahl der Fehlassemblierungen. Für ein vollständiges Bakteriengenom streben Sie einen N50-Wert an, der der Chromosomenlänge und dem GC-Gehalt entspricht, der mit der Referenz übereinstimmt. Überprüfen Sie die Vollständigkeit mit „BUSCO“ anhand der entsprechenden Abstammung: „busco -i contigs.fasta -lbakterien_odb10 -o busco_out -m genome“. Polieren Sie Baugruppen mit „Pilon“, um Fehler mithilfe von Leseausrichtungen zu korrigieren: „pilon –genome contigs.fasta –fragsaligned.bam –outputpoliert“. Für das Gerüst auf Chromosomenebene verwenden Sie „Hi-C“-Daten mit „SALSA2“ oder „3D-DNA“, um Contigs in Pseudomolekülen auf Chromosomenebene zu ordnen und auszurichten.
