Northern Blotting ist eine Labortechnik zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer RNA-Moleküle in einer biologischen Probe. Während ein Western Blot Proteine untersucht und ein Southern Blot DNA untersucht, teilt der Northern Blot den Wissenschaftlern mit, welche Gene zu einem bestimmten Zeitpunkt tatsächlich in einer Zelle „angeschaltet“ (exprimiert) werden. Durch die Messung der Menge an Boten-RNA (mRNA) können Forscher feststellen, ob eine Krankheit, ein Medikament oder eine Umweltveränderung dazu führt, dass eine Zelle die Produktion spezifischer Anweisungen beschleunigt oder einstellt.
So funktioniert Northern Blotting
RNA ist bekanntermaßen fragil und kann leicht durch Enzyme, sogenannte RNasen, abgebaut werden, die sich überall befinden – sogar auf Ihren Fingerspitzen. Aus diesem Grund erfordert der Prozess äußerste Sorgfalt und „saubere“ Bedingungen.
- RNA-Trennung
Die Gesamt-RNA wird aus den Zellen extrahiert und mittels Gelelektrophorese nach Größe aufgetrennt. Da RNA einzelsträngig ist, neigt sie dazu, sich in komplexe Formen zu falten; Um dies zu verhindern, wird dem Gel ein „denaturierendes“ Mittel (wie Formaldehyd) zugesetzt, um die RNA-Moleküle linear zu halten, sodass sie sich streng entsprechend ihrer Länge bewegen.
- Übertragen
Wie bei einem Western Blot werden die getrennten RNA-Stränge vom fragilen Gel auf eine stabile Nylon- oder Nitrozellulosemembran übertragen. Dies geschieht häufig durch Kapillarwirkung, wobei ein Stapel Papiertücher den SSC-Puffer (Kochsalzlösung-Natriumcitrat) durch das Gel und die Membran „saugt“, die RNA mit sich zieht und auf der Oberfläche der Membran festhält.
- Hybridisierung
Die Membran wird einer Sonde ausgesetzt – einem kurzen, einzelsträngigen Stück DNA oder RNA, das zur Zielsequenz komplementär ist. Diese Sonde ist mit einem radioaktiven Atom oder einem Fluoreszenzfarbstoff „markiert“. Die Sonde scannt die Membran und bindet (hybridisiert) nur an ihren passenden RNA-Partner und ignoriert alle anderen RNA-„Rauschen“.
- Erkennung
Nach dem Abwaschen der ungebundenen Sonden wird die Membran auf einen Röntgenfilm gelegt oder mit einem digitalen Bildgeber gescannt. Die markierten Sonden erzeugen dunkle Bänder oder leuchtende Linien. Die Dicke und Intensität der Bande verrät dem Wissenschaftler genau, wie viel dieser spezifischen mRNA in der Originalprobe vorhanden war.
