Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) ist eine Technik zum Nachweis und zur Amplifikation von RNA. Es kombiniert zwei Schritte: Reverse Transkription von RNA in komplementäre DNA (cDNA), gefolgt von PCR Amplifikation der cDNA. Dadurch können Wissenschaftler die Genexpression untersuchen und RNA-Viren nachweisen.
Wie RT-PCR funktioniert
- RNA-Extraktion
Die Gesamt-RNA wird aus der Probe extrahiert und mit DNase behandelt, um kontaminierende genomische DNA zu entfernen. Die RNA-Qualität und -Konzentration werden vor dem Fortfahren überprüft.
- Reverse Transkription
Die RNA wird mit dem Enzym Reverse Transkriptase, Zufallsprimern oder Oligo-dT-Primern und Nukleotiden gemischt. Die Reverse Transkriptase nutzt die RNA als Matrize, um einen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Die RNA-Matrize wird dann durch RNase H abgebaut, wodurch einzelsträngige cDNA zurückbleibt.
- PCR-Amplifikation
Die cDNA wird dann als Vorlage für die Standard-PCR mit genspezifischen Primern verwendet. Die PCR amplifiziert die cDNA und produziert genügend DNA, um sie auf einem Gel sichtbar zu machen oder durch qPCR zu quantifizieren.
- Erkennung
Die amplifizierten PCR-Produkte werden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Das Vorhandensein einer Bande in der erwarteten Größe bestätigt, dass die Ziel-RNA in der Originalprobe vorhanden war.
- Bewerbungen
RT-PCR wird häufig zur Messung des Genexpressionsniveaus, zum Nachweis von RNA-Viren wie HIV und SARS-CoV-2, zur Validierung von RNA-Sequenzierungsdaten und zur Analyse alternativer Spleiße eingesetzt. In Kombination mit qPCR wird daraus RT-qPCR, was eine Echtzeitquantifizierung von RNA ermöglicht.
