Übersicht
Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) misst das Transkriptom einzelner Zellen und ermöglicht so eine beispiellose Auflösung der zellulären Heterogenität. Bulk-RNA-Seq ermittelt den Durchschnitt der Genexpression über Millionen von Zellen und maskiert so die unterschiedlichen Transkriptionszustände verschiedener Zelltypen. Im Gegensatz dazu erfasst scRNA-seq das Expressionsprofil jeder Zelle separat und ermöglicht so die Entdeckung seltener Zellpopulationen, die Rekonstruktion von Entwicklungsverläufen und die Charakterisierung zelltypspezifischer Reaktionen. Seit der ersten scRNA-seq-Studie im Jahr 2009 hat sich die Technologie rasant weiterentwickelt, wobei moderne Plattformen Zehntausende von Zellen in einem einzigen Experiment profilieren.
Methoden
Der scRNA-seq-Workflow umfasst die Zellisolierung (unter Verwendung tröpfchenbasierter Plattformen wie 10x Genomics Chromium, Mikrofluidik wie Fluidigm C1 oder plattenbasierter Methoden), die umgekehrte Transkription mit eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMIs) zur Beseitigung von Amplifikationsverzerrungen und die Vorbereitung der Bibliothek für die Sequenzierung. Die bioinformatische Analyse erfolgt durch: Qualitätskontrolle (Filterung von Zellen nach Genzahl, Mitochondriengehalt und UMI-Anzahl), Normalisierung (SCTransform, scran oder BASiCS), Batch-Korrektur (Harmony, Seurats CCA oder scVI), Dimensionalitätsreduzierung (PCA gefolgt von UMAP- oder t-SNE-Visualisierung), Clustering (Louvain- oder Leiden-Algorithmen) und differentieller Ausdruck zwischen Clustern. Bei der Annotation von Zelltypen werden Markergene und Referenzdatenbanken verwendet.
Anwendungen
scRNA-seq hat mehrere Bereiche verändert. Es wurden umfassende Zellatlanten für menschliche Organe erstellt, der sich entwickelnde Embryo kartiert und bisher unbekannte Zellsubtypen im Gehirn und Immunsystem entdeckt. In der Krebsforschung untersucht scRNA-seq die Tumorheterogenität und die Tumormikroumgebung und identifiziert seltene arzneimittelresistente Zellzustände im Zusammenhang mit der Durchflusszytometrie Marker. Die Technik basiert auf den Kernprinzipien der RNA-Sequenzierung und den Konzepten von DNA-Microarrays und Genexpression. Neue Methoden der räumlichen Transkriptomik fügen nun Positionskontext zu Einzelzelldaten hinzu und offenbaren, wie Zellen sich innerhalb von Geweben organisieren.
Praktisches Protokoll
Ein typisches 10x-Genomics-scRNA-seq-Experiment beginnt mit der Herstellung einer Einzelzellsuspension mit einer Konzentration von 700–1200 Zellen/µL und einer Lebensfähigkeit von über 90 %. Der Chromium Controller unterteilt Zellen in Gel-Bead-In-Emulsions (GEMs) im Nanoliter-Maßstab, die jeweils ein Barcode-Bead mit eindeutigen 10-fach-Barcodes und UMIs enthalten. Nach der umgekehrten Transkription innerhalb von GEMs wird die mit dem Barcode versehene cDNA gepoolt und amplifiziert. Der Bibliotheksaufbau umfasst enzymatische Fragmentierung, Endreparatur, A-Tailing, Adapterligation und Probenindex-PCR. Die Sequenzierung wird auf einer Illumina-Plattform mit einer Lesekonfiguration von R1 28 Zyklen (10x Barcode und UMI), R2 91 Zyklen (cDNA-Insert) und i7 Index 8 Zyklen durchgeführt. Die Cell Ranger-Pipeline verarbeitet rohe BCL-Dateien mit „cellranger mkfastq“ in FASTQs und richtet dann Lesevorgänge über „cellranger count“ auf das Referenzgenom mit STAR aus. Die Ausgabe umfasst gefilterte Feature-Barcode-Matrizen, UMAP-Einbettungen und Clustering-Ergebnisse. Die nachgelagerte Analyse in R verwendet Seurat: „CreateSeuratObject“, „SCTransform“ zur Normalisierung, „RunPCA“ und „RunUMAP“ zur Dimensionsreduzierung und „FindClusters“ mit dem Leiden-Algorithmus. In Python bietet Scanpy analoge Funktionen: „sc.pp.filter_cells“, „sc.pp.normalize_total“, „sc.pp.log1p“, „sc.tl.pca“ und „sc.tl.leiden“. Vor dem Clustering wird die Dubletterkennung mit „DoubletFinder“ oder „scrublet“ empfohlen, und die Batch-Integration über Proben hinweg kann mit „Harmony“ oder „scVI“ durchgeführt werden.
