Überblick

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) misst das Transkriptom einzelner Zellen und bietet eine beispiellose Auflösung der zellulären Heterogenität. Bulk-RNA-seq mittelt die Genexpression über Millionen von Zellen und verbirgt die unterschiedlichen transkriptionellen Zustände verschiedener Zelltypen. Im Gegensatz dazu erfasst scRNA-seq das Expressionsprofil jeder Zelle separat und ermöglicht die Entdeckung seltener Zellpopulationen, die Rekonstruktion von Entwicklungstrajektorien und die Charakterisierung zelltypspezifischer Antworten. Seit der ersten scRNA-seq-Studie im Jahr 2009 hat sich die Technologie rasant weiterentwickelt, wobei moderne Plattformen Zehntausende von Zellen in einem einzigen Experiment profilieren.

Methoden

Der scRNA-seq-Workflow umfasst die Zellisolierung (mittels Tröpfchen-basierter Plattformen wie 10x Genomics Chromium, Mikrofluidik wie Fluidigm C1 oder Platten-basierter Methoden), reverse Transkription mit einzigartigen molekularen Identifikatoren (UMIs) zur Entfernung von Amplifikationsverzerrungen und Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung. Die bioinformatische Analyse durchläuft: Qualitätskontrolle (Filtern von Zellen nach Genzahl, mitochondrialem Gehalt und UMI-Zählungen), Normalisierung (SCTransform, scran oder BASiCS), Batch-Korrektur (Harmony, Seurats CCA oder scVI), Dimensionsreduktion (PCA gefolgt von UMAP- oder t-SNE-Visualisierung), Clusterung (Louvain- oder Leiden-Algorithmen) und differentielle Expression zwischen Clustern. Die Zelltypannotation verwendet Markergene und Referenzdatenbanken.

Anwendungen

scRNA-seq hat mehrere Fachgebiete transformiert. Es hat umfassende Zellatlanten für menschliche Organe erstellt, den sich entwickelnden Embryo kartiert und bisher unbekannte Zellsubtypen im Gehirn und Immunsystem aufgedeckt. In der Krebsforschung analysiert scRNA-seq die Tumorheterogenität und die Tumormikroumgebung und identifiziert seltene arzneimittelresistente Zellzustände, die mit Durchflusszytometrie-Markern zusammenhängen. Die Technik baut auf grundlegenden RNA-Sequenzierung-Prinzipien und DNA-Microarray- und Genexpressions-Konzepten auf. Neue räumliche Transkriptomik-Methoden fügen den Einzelzelldaten nun einen positionsbezogenen Kontext hinzu und zeigen, wie Zellen innerhalb von Geweben organisiert sind.