Die Durchflusszytometrie ist eine laserbasierte Technologie, die physikalische und chemische Eigenschaften tausender einzelner Zellen pro Sekunde schnell misst, während sie in einem einzelligen Strom an optischen Detektoren vorbeifließen. Sie ermöglicht die multiparametrische Analyse von Zellpopulationen mit Einzelzellauflösung.

Prinzipien

Zellen in Suspension werden hydrodynamisch zu einem schmalen Strom fokussiert, was sicherstellt, dass sie einzeln den Messpunkt passieren, an dem ein oder mehrere Laserstrahlen den Strom kreuzen. Wenn jede Zelle den Laser passiert, streut sie Licht und emittiert Fluoreszenz, wenn sie mit Fluorophoren markiert ist. Das gestreute und emittierte Licht wird von Detektoren gesammelt, in elektronische Signale umgewandelt und für die Analyse digitalisiert.

Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht

Der Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter) misst das unter kleinen Winkeln gestreute Licht und korreliert mit der Zellgröße. Größere Zellen streuen mehr Licht in Vorwärtsrichtung. Das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter) misst das unter 90 Grad gestreute Licht und spiegelt die Zellgranularität und innere Komplexität wider. Neutrophile mit vielen Granula haben ein hohes Seitwärtsstreulicht, während Lymphozyten ein niedriges Seitwärtsstreulicht haben. Zusammen können FSC und SSC wichtige Leukozytenpopulationen im Blut ohne jegliche Färbung unterscheiden.

Fluoreszenzdetektion

Fluoreszenz wird emittiert, wenn durch den Laser angeregte Fluorophore in ihren Grundzustand zurückkehren. Zellen werden typischerweise mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt, die gegen spezifische Oberflächen- oder intrazelluläre Marker gerichtet sind, ähnlich der Antikörper-basierten Detektion im ELISA. Jedes Fluorophor hat charakteristische Anregungs- und Emissionsspektren. Durchflusszytometer verwenden dichroitische Spiegel und Bandpassfilter, um Fluoreszenz in verschiedene Detektorkanäle aufzutrennen, die jeweils einen bestimmten Wellenlängenbereich messen.

Fluorophore

Häufige Fluorophore umfassen FITC, PE, APC, PerCP und Alexa-Fluor-Farbstoffe. Tandem-Farbstoffe wie PE-Cy7 kombinieren zwei Fluorophore, wobei der Energietransfer vom Donor zum Akzeptor einen großen Stokes-Shift erzeugt. Moderne Zytometer können 12 bis 50 Parameter gleichzeitig unter Verwendung mehrerer Laser und Detektoren messen.

Die Kompensation korrigiert die spektrale Überlappung zwischen Fluorophoren. Wenn das Emissionsspektrum eines Fluorophors in den Detektor eines anderen überlappt, muss der Beitrag mathematisch subtrahiert werden. Kompensationskontrollen mit einfach gefärbten Proben sind für eine genaue Mehrfarbenanalyse unerlässlich.

Zellsortierung

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung trennt Zellen physikalisch basierend auf ihren gemessenen Eigenschaften. Der Sortierer verwendet eine vibrierende Düse, um Tröpfchen zu erzeugen, die einzelne Zellen enthalten. Tröpfchen werden basierend auf den gemessenen Eigenschaften der Zelle elektrisch geladen und durch elektrostatische Platten in Auffanggefäße abgelenkt. Die Sortierreinheit übersteigt typischerweise 95 %. Asptische Sortierung ist für nachfolgende Kultur oder funktionelle Assays möglich.

Anwendungen

Die Immunphänotypisierung identifiziert und quantifiziert Immunzell-Subpopulationen unter Verwendung von Panels linienspezifischer Marker. CD4-T-Zellzählungen bei der HIV-Überwachung sind eine klinische Anwendung der Durchflusszytometrie. Die Zellzyklusanalyse misst den DNA-Gehalt unter Verwendung von Propidiumiodid- oder DAPI-Färbung und identifiziert G1-, S-, G2- und M-Phasen-Populationen.

Apoptose-Assays detektieren die Phosphatidylserin-Exposition mit Annexin V, Membranpermeabilität mit Propidiumiodid oder 7-AAD und Caspase-Aktivierung mit fluoreszierenden Inhibitoren. Die intrazelluläre Zytokinfärbung misst die Zytokinproduktion in aktivierten T-Zellen. Die Phospho-Flow-Messung misst die Phosphorylierung von Signalproteinen mit Einzelzellauflösung, analog zum Western Blot. Die Expression fluoreszierender Proteine aus Reporterkonstrukten wie GFP kann ohne Antikörperfärbung gemessen werden.

Spektrale Durchflusszytometrie

Die spektrale Durchflusszytometrie verwendet ein Beugungsgitter oder Prisma, um das vollständige Emissionsspektrum jeder Zelle über viele Detektoren hinweg zu erfassen, anstatt in diskreten Kanälen zu messen. Spektrale Entmischungsalgorithmen entfalten den Beitrag jedes Fluorophors. Dieser Ansatz ermöglicht mehr Fluorophore mit ähnlichen Spektren und vereinfacht das Panel-Design durch Reduzierung der Kompensationsanforderungen.

Massenzytometrie

Die Massenzytometrie verwendet Antikörper, die mit stabilen Schwermetallisotopen anstelle von Fluorophoren konjugiert sind. Zellen werden in ein induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometer eingeführt, das die Metalle atomisiert und ionisiert. Jede Isotopenmasse wird durch Flugzeit-Massenspektrometrie gemessen. Die Massenzytometrie kann 40 oder mehr Parameter ohne spektrale Überlappung oder Autofluoreszenz messen. Die Zellen werden jedoch während der Analyse zerstört und können nicht zurückgewonnen werden. Die Technologie hat einen geringeren Durchsatz als die konventionelle Durchflusszytometrie.