Sitometri aliran adalah teknologi berbasis laser yang dengan cepat mengukur sifat fisik dan kimia dari ribuan sel individu per detik saat mereka mengalir dalam aliran satu file melewati detektor optik. Ini memungkinkan analisis multiparametrik populasi sel pada resolusi sel tunggal.
Prinsip
Sel dalam suspensi difokuskan secara hidrodinamik menjadi aliran sempit, memastikan mereka melewati secara individual melalui titik interogasi di mana satu atau lebih sinar laser memotong aliran. Saat setiap sel melewati laser, ia menghamburkan cahaya dan memancarkan fluoresensi jika dilabeli dengan fluorofor. Cahaya yang dihamburkan dan dipancarkan dikumpulkan oleh detektor, diubah menjadi sinyal elektronik, dan didigitalkan untuk analisis.
Hamburan Maju dan Samping
Hamburan maju mengukur cahaya yang dihamburkan pada sudut kecil, berkorelasi dengan ukuran sel. Sel yang lebih besar menghamburkan lebih banyak cahaya ke arah depan. Hamburan samping mengukur cahaya yang dihamburkan pada 90 derajat, mencerminkan granularitas sel dan kompleksitas internal. Neutrofil dengan banyak granula memiliki hamburan samping tinggi, sementara limfosit memiliki hamburan samping rendah. Bersama-sama, FSC dan SSC dapat membedakan populasi leukosit utama dalam darah tanpa pewarnaan.
Deteksi Fluoresensi
Fluoresensi dipancarkan ketika fluorofor yang dieksitasi oleh laser kembali ke keadaan dasarnya. Sel biasanya diwarnai dengan antibodi terkonjugasi fluoresen yang menargetkan penanda permukaan atau intraseluler spesifik, mirip dengan deteksi berbasis antibodi dalam ELISA. Setiap fluorofor memiliki spektrum eksitasi dan emisi karakteristik. Sitometer aliran menggunakan cermin dikroik dan filter pita sempit untuk memisahkan fluoresensi ke dalam saluran detektor yang berbeda, masing-masing mengukur rentang panjang gelombang spesifik.
Fluorofor
Fluorofor umum termasuk FITC, PE, APC, PerCP, dan pewarna Alexa Fluor. Pewarna tandem seperti PE-Cy7 menggabungkan dua fluorofor, di mana transfer energi dari donor ke akseptor menghasilkan pergeseran Stokes besar. Sitometer modern dapat mengukur 12 hingga 50 parameter secara simultan menggunakan beberapa laser dan detektor.
Kompensasi memperbaiki tumpang tindih spektral antara fluorofor. Ketika spektrum emisi satu fluorofor tumpah ke detektor lain, kontribusinya harus dikurangkan secara matematis. Kontrol kompensasi menggunakan sampel pewarnaan tunggal sangat penting untuk analisis multiwarna yang akurat.
Pemilahan Sel
Pemilahan sel yang diaktifkan fluoresensi secara fisik memisahkan sel berdasarkan sifat yang diukur. Pemilah menggunakan nosel bergetar untuk menghasilkan tetesan yang mengandung sel tunggal. Tetesan diberi muatan listrik berdasarkan karakteristik sel yang diukur dan dibelokkan oleh pelat elektrostatik ke dalam tabung koleksi. Kemurnian pemilahan biasanya melebihi 95%. Pemilahan aseptik dimungkinkan untuk kultur hilir atau uji fungsional.
Aplikasi
Imunofenotip mengidentifikasi dan mengkuantifikasi subset sel imun menggunakan panel penanda spesifik garis keturunan. Hitung sel CD4 dalam pemantauan HIV adalah aplikasi klinis sitometri aliran. Analisis siklus sel mengukur konten DNA menggunakan pewarnaan propidium iodida atau DAPI, mengidentifikasi populasi fase G1, S, G2, dan M.
Uji apoptosis mendeteksi paparan fosfatidilserin dengan annexin V, permeabilitas membran dengan propidium iodida atau 7-AAD, dan aktivasi kaspase dengan inhibitor fluoresen. Pewarnaan sitokin intraseluler mengukur produksi sitokin dalam sel T yang diaktifkan. Fosfo-aliran mengukur fosforilasi protein pensinyalan pada resolusi sel tunggal, analog dengan analisis Western blot. Ekspresi protein fluoresen dari reporter seperti GFP dapat diukur tanpa pewarnaan antibodi.
Sitometri Aliran Spektral
Sitometri aliran spektral menggunakan kisi difraksi atau prisma untuk menangkap spektrum emisi penuh setiap sel di banyak detektor, daripada mengukur dalam saluran diskrit. Algoritma pemisahan spektral mendekonvolusi kontribusi setiap fluorofor. Pendekatan ini mengakomodasi lebih banyak fluorofor dengan spektrum serupa dan menyederhanakan desain panel dengan mengurangi kebutuhan kompensasi.
Sitometri Massa
Sitometri massa menggunakan antibodi yang terkonjugasi ke isotop logam berat stabil daripada fluorofor. Sel dimasukkan ke dalam spektrometer massa plasma induktif berpasangan, yang mengatomisasi dan mengionisasi logam. Setiap massa isotop diukur oleh spektrometri massa waktu tempuh. Sitometri massa dapat mengukur 40 parameter atau lebih tanpa tumpang tindih spektral atau autofluoresensi. Namun, sel dihancurkan selama analisis dan tidak dapat diperoleh kembali. Teknologi ini memiliki throughput lebih rendah daripada sitometri aliran konvensional.
