La cytométrie en flux est une technologie laser qui mesure rapidement les propriétés physiques et chimiques de milliers de cellules individuelles par seconde alors qu’elles s’écoulent en file indienne devant des détecteurs optiques. Elle permet l’analyse multiparamétrique de populations cellulaires à résolution unicellulaire.

Principes

Les cellules en suspension sont focalisées hydrodynamiquement en un flux étroit, garantissant qu’elles passent individuellement au point d’interrogation où un ou plusieurs faisceaux laser croisent le flux. Lorsque chaque cellule traverse le laser, elle diffuse la lumière et émet une fluorescence si elle est marquée avec des fluorophores. La lumière diffusée et émise est collectée par des détecteurs, convertie en signaux électroniques et numérisée pour analyse.

Diffusion avant et latérale

La diffusion avant mesure la lumière diffusée à de petits angles, corrélant avec la taille cellulaire. Les cellules plus grandes diffusent plus de lumière vers l’avant. La diffusion latérale mesure la lumière diffusée à 90 degrés, reflétant la granularité et la complexité interne des cellules. Les neutrophiles avec de nombreux granules ont une diffusion latérale élevée, tandis que les lymphocytes ont une diffusion latérale faible. Ensemble, le FSC et le SSC peuvent distinguer les principales populations leucocytaires dans le sang sans aucun marquage.

Détection de fluorescence

La fluorescence est émise lorsque les fluorophores excités par le laser retournent à leur état fondamental. Les cellules sont généralement marquées avec des anticorps conjugués à des fluorophores ciblant des marqueurs de surface ou intracellulaires spécifiques, similaire à la détection basée sur les anticorps dans ELISA. Chaque fluorophore a des spectres d’excitation et d’émission caractéristiques. Les cytomètres en flux utilisent des miroirs dichroïques et des filtres passe-bande pour séparer la fluorescence en canaux de détection distincts, chacun mesurant une gamme de longueurs d’onde spécifique.

Fluorophores

Les fluorophores courants comprennent le FITC, le PE, l’APC, le PerCP et les colorants Alexa Fluor. Les colorants en tandem tels que PE-Cy7 combinent deux fluorophores, où le transfert d’énergie du donneur à l’accepteur produit un grand déplacement de Stokes. Les cytomètres modernes peuvent mesurer 12 à 50 paramètres simultanément en utilisant plusieurs lasers et détecteurs.

La compensation corrige le recouvrement spectral entre les fluorophores. Lorsque le spectre d’émission d’un fluorophore déborde dans le détecteur d’un autre, la contribution doit être soustraite mathématiquement. Les contrôles de compensation utilisant des échantillons marqués individuellement sont essentiels pour une analyse multicolore précise.

Tri cellulaire

Le tri cellulaire activé par fluorescence sépare physiquement les cellules en fonction de leurs propriétés mesurées. Le trieur utilise une buse vibrante pour générer des gouttelettes contenant des cellules uniques. Les gouttelettes sont chargées électriquement en fonction des caractéristiques mesurées de la cellule et déviées par des plaques électrostatiques dans des tubes de collecte. La pureté de tri dépasse généralement 95 %. Le tri aseptique est possible pour la culture en aval ou les tests fonctionnels.

Applications

L’immunophénotypage identifie et quantifie les sous-ensembles de cellules immunitaires en utilisant des panels de marqueurs spécifiques de lignée. Les comptages de cellules T CD4 dans la surveillance du VIH sont une application clinique de la cytométrie en flux. L’analyse du cycle cellulaire mesure le contenu en ADN en utilisant l’iodure de propidium ou le DAPI, identifiant les populations des phases G1, S, G2 et M.

Les tests d’apoptose détectent l’exposition de la phosphatidylsérine avec l’annexine V, la perméabilité membranaire avec l’iodure de propidium ou le 7-AAD, et l’activation des caspases avec des inhibiteurs fluorescents. Le marquage intracellulaire des cytokines mesure la production de cytokines dans les cellules T activées. Le phospho-flux mesure la phosphorylation des protéines de signalisation à résolution unicellulaire, analogue à l’analyse par Western blot. L’expression de protéines fluorescentes à partir de rapporteurs tels que la GFP peut être mesurée sans marquage par anticorps.

Cytométrie en flux spectrale

La cytométrie en flux spectrale utilise un réseau de diffraction ou un prisme pour capturer le spectre d’émission complet de chaque cellule sur de nombreux détecteurs, plutôt que de mesurer dans des canaux discrets. Les algorithmes de déconvolution spectrale démêlent la contribution de chaque fluorophore. Cette approche permet d’utiliser plus de fluorophores avec des spectres similaires et simplifie la conception des panels en réduisant les besoins de compensation.

Cytométrie de masse

La cytométrie de masse utilise des anticorps conjugués à des isotopes de métaux lourds stables plutôt qu’à des fluorophores. Les cellules sont introduites dans un spectromètre de masse à plasma induit, qui atomise et ionise les métaux. Chaque masse isotopique est mesurée par spectrométrie de masse à temps de vol. La cytométrie de masse peut mesurer 40 paramètres ou plus sans recouvrement spectral ni autofluorescence. Cependant, les cellules sont détruites pendant l’analyse et ne peuvent pas être récupérées. La technologie a un débit plus faible que la cytométrie en flux conventionnelle.