A citometria de fluxo é uma tecnologia baseada em laser que mede rapidamente propriedades físicas e químicas de milhares de células individuais por segundo enquanto fluem em uma corrente de fileira única passando por detectores ópticos. Permite análise multiparamétrica de populações celulares com resolução de célula única.

Princípios

Células em suspensão são focalizadas hidrodinamicamente em um fluxo estreito, garantindo que passem individualmente pelo ponto de interrogação onde um ou mais feixes de laser intersectam o fluxo. Conforme cada célula passa pelo laser, ela dispersa a luz e emite fluorescência se marcada com fluoróforos. A luz dispersa e emitida é coletada por detectores, convertida em sinais eletrônicos e digitalizada para análise.

Dispersão Direta e Lateral

A dispersão direta mede a luz dispersa em pequenos ângulos, correlacionando-se com o tamanho celular. Células maiores dispersam mais luz na direção direta. A dispersão lateral mede a luz dispersa a 90 graus, refletindo a granularidade e complexidade interna da célula. Neutrófilos com muitos grânulos têm alta dispersão lateral, enquanto linfócitos têm baixa dispersão lateral. Juntos, FSC e SSC podem distinguir as principais populações leucocitárias no sangue sem qualquer coloração.

Detecção de Fluorescência

A fluorescência é emitida quando fluoróforos excitados pelo laser retornam ao seu estado fundamental. As células são tipicamente coradas com anticorpos conjugados a fluoróforos direcionados a marcadores de superfície ou intracelulares específicos, similar à detecção baseada em anticorpos no ELISA. Cada fluoróforo tem espectros de excitação e emissão característicos. Os citômetros de fluxo usam espelhos dicroicos e filtros de banda para separar a fluorescência em canais distintos de detectores, cada um medindo uma faixa de comprimento de onda específica.

Fluoróforos

Fluoróforos comuns incluem FITC, PE, APC, PerCP e corantes Alexa Fluor. Corantes tandem como PE-Cy7 combinam dois fluoróforos, onde a transferência de energia do doador para o acceptor produz um grande deslocamento de Stokes. Citômetros modernos podem medir 12 a 50 parâmetros simultaneamente usando múltiplos lasers e detectores.

A compensação corrige a sobreposição espectral entre fluoróforos. Quando o espectro de emissão de um fluoróforo transborda para o detector de outro, a contribuição deve ser matematicamente subtraída. Controles de compensação usando amostras coradas com um único fluoróforo são essenciais para análise multicolor precisa.

Separação Celular

A separação celular ativada por fluorescência separa fisicamente as células com base em suas propriedades medidas. O separador usa um bico vibratório para gerar gotículas contendo células únicas. As gotículas são carregadas eletricamente com base nas características medidas da célula e desviadas por placas eletrostáticas para tubos de coleta. A pureza da separação tipicamente excede 95%. A separação asséptica é possível para cultura downstream ou ensaios funcionais.

Aplicações

A imunofenotipagem identifica e quantifica subconjuntos de células imunes usando painéis de marcadores específicos de linhagem. As contagens de células T CD4 no monitoramento do HIV são uma aplicação clínica da citometria de fluxo. A análise do ciclo celular mede o conteúdo de DNA usando coloração com iodeto de propídio ou DAPI, identificando populações nas fases G1, S, G2 e M.

Ensaios de apoptose detectam exposição de fosfatidilserina com anexina V, permeabilidade de membrana com iodeto de propídio ou 7-AAD e ativação de caspase com inibidores fluorescentes. A coloração intracelular de citocinas mede a produção de citocinas em células T ativadas. O phospho-flow mede a fosforilação de proteínas de sinalização em resolução de célula única, análogo à análise de Western blot. A expressão de proteínas fluorescentes de repórteres como GFP pode ser medida sem coloração com anticorpos.

Citometria de Fluxo Espectral

A citometria de fluxo espectral usa uma rede de difração ou prisma para capturar o espectro de emissão completo de cada célula através de muitos detectores, em vez de medir em canais discretos. Algoritmos de separação espectral desconvoluem a contribuição de cada fluoróforo. Esta abordagem acomoda mais fluoróforos com espectros semelhantes e simplifica o desenho do painel ao reduzir os requisitos de compensação.

Citometria de Massa

A citometria de massa usa anticorpos conjugados a isótopos estáveis de metais pesados em vez de fluoróforos. As células são introduzidas em um espectrômetro de massa com plasma indutivamente acoplado, que atomiza e ioniza os metais. Cada massa isotópica é medida por espectrometria de massa por tempo de voo. A citometria de massa pode medir 40 ou mais parâmetros sem sobreposição espectral ou autofluorescência. No entanto, as células são destruídas durante a análise e não podem ser recuperadas. A tecnologia tem menor rendimento que a citometria de fluxo convencional.