O Western Blotting (também chamado de imunoblotting de proteínas) é uma técnica laboratorial usada para detectar uma proteína específica dentro de uma amostra biológica complexa. Enquanto a SDS-PAGE separa proteínas por tamanho, ela não pode dizer qual proteína é qual — muitas proteínas diferentes podem ter o mesmo peso. O Western Blotting resolve isso usando anticorpos que atuam como mísseis de busca de calor, ligando-se apenas à proteína específica que um cientista deseja estudar.
Como Funciona o Western Blotting
Após as proteínas terem sido separadas por SDS-PAGE, elas ainda estão presas dentro do gel frágil. O Western blotting as transfere para uma superfície resistente onde são detectadas usando anticorpos.
- Transferência
As proteínas são transferidas do gel de poliacrilamida para uma membrana fina e durável (geralmente nitrocelulose ou PVDF). Aplicando um campo elétrico perpendicular ao gel, as proteínas são empurradas para fora do gel e aderem firmemente à superfície da membrana, criando uma réplica exata do padrão de separação original.
- Bloqueio
A membrana é muito pegajosa e capturará qualquer proteína que tocar. Para evitar que os anticorpos grudem nos espaços vazios da membrana (o que criaria um fundo escuro e bagunçado), a membrana é embebida em uma solução de “bloqueio” — frequentemente uma mistura de proteínas diluídas como leite seco desnatado ou albumina de soro bovino (BSA).
- Incubação com Anticorpos
A membrana é tratada com um Anticorpo Primário projetado para reconhecer apenas a proteína alvo. Após lavar os anticorpos primários não ligados, um Anticorpo Secundário é adicionado. Este segundo anticorpo reconhece o primeiro e geralmente está ligado a uma enzima ou a um corante fluorescente que atua como sinal.
- Detecção
Para ver os resultados, um substrato químico é adicionado que reage com a enzima no anticorpo secundário, produzindo luz (quimioluminescência) ou um depósito colorido. Isso cria uma banda escura em um filme ou imagem digital, confirmando não apenas o tamanho da proteína, mas sua identidade exata e quanto dela está presente.
