流式细胞术是一种基于激光的技术，可快速测量每秒数千个单个细胞（以单列流经过光学检测器）的物理和化学特性。它能够在单细胞分辨率下对细胞群进行多参数分析。

原理

悬浮中的细胞被流体动力学聚焦成狭窄的流，确保它们逐个通过一个或多个激光束与流相交的检测点。当每个细胞通过激光时，它散射光并在标记有荧光团时发射荧光。散射和发射的光被检测器收集，转换为电子信号，并数字化以供分析。

前向散射和侧向散射

前向散射测量以小角度散射的光，与细胞大小相关。较大的细胞在前向方向散射更多光。侧向散射测量以90度角散射的光，反映细胞颗粒度和内部复杂性。具有许多颗粒的中性粒细胞具有较高的侧向散射，而淋巴细胞具有较低的侧向散射。FSC和SSC一起可以在不进行任何染色的情况下区分血液中的主要白细胞群体。

荧光检测

当被激光激发的荧光团返回基态时发出荧光。细胞通常用荧光标记的抗体染色，靶向特定的表面或细胞内标志物，类似于ELISA中基于抗体的检测。每个荧光团具有特征性的激发和发射光谱。流式细胞仪使用二色镜和带通滤光片将荧光分离到不同的检测器通道，每个通道测量特定的波长范围。

荧光团

常见荧光团包括FITC、PE、APC、PerCP和Alexa Fluor染料。串联染料如PE-Cy7结合两种荧光团，从供体到受体的能量转移产生大的斯托克斯位移。现代细胞仪可使用多个激光器和检测器同时测量12至50个参数。

补偿校正荧光团之间的光谱重叠。当一个荧光团的发射光谱泄漏到另一个检测器时，贡献必须被数学减去。使用单染样本的补偿对照对于准确的多色分析至关重要。

细胞分选

荧光激活细胞分选根据测量的特性物理分离细胞。分选仪使用振动喷嘴产生含有单个细胞的液滴。液滴根据细胞测量特性带电，并通过静电板偏转到收集管中。分选纯度通常超过95%。无菌分选可用于下游培养或功能分析。

应用

免疫表型分型使用谱系特异性标志物组鉴定和量化免疫细胞亚群。HIV监测中的CD4 T细胞计数是流式细胞术的临床应用。细胞周期分析使用碘化丙啶或DAPI染色测量DNA含量，鉴定G1、S、G2和M期群体。

凋亡测定用膜联蛋白V检测磷脂酰丝氨酸暴露，用碘化丙啶或7-AAD检测膜通透性，用荧光抑制剂检测caspase激活。细胞内细胞因子染色测量活化T细胞中的细胞因子产生。磷酸化流式在单细胞分辨率下测量信号蛋白的磷酸化，类似于Western印迹分析。来自报告基因如GFP的荧光蛋白表达可以在没有抗体染色的情况下测量。

光谱流式细胞术

光谱流式细胞术使用衍射光栅或棱镜捕获每个细胞在多个检测器上的全发射光谱，而不是在离散通道中测量。光谱拆分算法反卷积每个荧光团的贡献。这种方法容纳更多具有相似光谱的荧光团，并通过减少补偿要求简化了面板设计。

质谱流式细胞术

质谱流式细胞术使用与稳定重金属同位素而非荧光团结合的抗体。细胞被引入电感耦合等离子体质谱仪，将金属原子化和离子化。每个同位素质量通过飞行时间质谱测量。质谱流式细胞术可以测量40个或更多参数而没有光谱重叠或自发荧光。然而，细胞在分析过程中被破坏且无法回收。该技术的通量低于传统流式细胞术。