Überblick

Die Small-RNA-Sequenzierung zielt auf die Klasse kurzer nicht-kodierender RNA-Moleküle ab — typischerweise 18–35 Nukleotide lang — die eine entscheidende regulatorische Rolle bei der Genexpression spielen. Dazu gehören microRNAs (miRNAs), small interfering RNAs (siRNAs) und Piwi-interacting RNAs (piRNAs). Trotz ihrer geringen Größe üben diese Moleküle eine starke Kontrolle über mRNA-Stabilität, Translation, Chromatinkompartiment und Transposon-Silencing aus. Small-RNA-seq erfordert eine spezielle Bibliotheksvorbereitung, um solch kurze Fragmente zu erfassen, sowie eigene bioinformatische Werkzeuge für eine genaue Annotation und Quantifizierung.

Methoden

Die Bibliotheksvorbereitung für Small-RNA-seq umfasst die Größenauswahl der RNA (typischerweise durch Gel-Exzision oder Bead-basierte Reinigung), Ligation von 3’- und 5’-Adaptern, reverse Transkription und PCR-Amplifikation. Da Small-RNAs kürzer als die Read-Länge sind, werden sie vollständig sequenziert, und die Adaptersequenzen müssen während der Vorverarbeitung präzise entfernt werden. Spezielle Alignment-Werkzeuge (wie miRDeep2, sRNAbench oder ShortStack) kartieren Reads auf bekannte Small-RNA-Datenbanken (miRBase für miRNAs, Rfam für andere ncRNAs). Die Quantifizierung schätzt Expressionsniveaus bekannter miRNAs, während die Erkennung neuer miRNAs auf charakteristischen Hairpin-Vorläuferstrukturen beruht. Die differentielle Expressionsanalyse folgt ähnlichen Prinzipien wie mRNA-seq, erfordert jedoch besondere Überlegungen zur Normalisierung, da Small-RNAs unterschiedliche Längenverteilungen und GC-Verzerrungen aufweisen.

Anwendungen

Die Small-RNA-Profilierung hat die allgegenwärtigen regulatorischen Rollen dieser Moleküle aufgedeckt. miRNA-Signaturen unterscheiden Krebs-Subtypen und sagen das Behandlungsergebnis voraus. Zirkulierende miRNAs in Blut oder Serum dienen als minimalinvasive Biomarker für Erkrankungen wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Neurodegeneration. Die Analyse verbindet sich mit breiteren Studien zur RNA-Struktur und -Typen und zur Genregulation und Epigenetik, da viele Small-RNAs an regulatorischen Kreisläufen mit Transkriptionsfaktoren und epigenetischen Modifikatoren teilnehmen. Das Verständnis der Small-RNA-Biogenese baut auch auf Konzepten der Transkription und RNA-Prozessierung auf, insbesondere der Rolle von Drosha und Dicer bei der miRNA-Reifung.