Visión General
La secuenciación de ARN pequeño se dirige a la clase de moléculas de ARN no codificante cortas — típicamente de 18 a 35 nucleótidos de longitud — que desempeñan funciones reguladoras críticas en la expresión génica. Estas incluyen microARNs (miRNAs), ARN pequeños interferentes (siRNAs) y ARN asociados a Piwi (piRNAs). A pesar de su pequeño tamaño, estas moléculas ejercen un poderoso control sobre la estabilidad del ARNm, la traducción, el estado de la cromatina y el silenciamiento de transposones. El RNA-seq pequeño requiere preparación de bibliotecas especializada para capturar fragmentos tan cortos y herramientas bioinformáticas distintas para una anotación y cuantificación precisas.
Métodos
La preparación de bibliotecas para RNA-seq pequeño implica la selección por tamaño del ARN (típicamente mediante excisión en gel o purificación basada en perlas), ligación de adaptadores 3’ y 5’, transcripción inversa y amplificación por PCR. Debido a que los ARN pequeños son más cortos que la longitud de lectura, se secuencian completamente y las secuencias de los adaptadores deben recortarse con precisión durante el preprocesamiento. Las herramientas de alineamiento dedicadas (como miRDeep2, sRNAbench o ShortStack) mapean las lecturas a bases de datos de ARN pequeño conocidas (miRBase para miRNAs, Rfam para otros ARNnc). La cuantificación estima los niveles de expresión de miRNAs conocidos, mientras que la detección de nuevos miRNAs se basa en estructuras precursoras características de horquilla. El análisis de expresión diferencial sigue principios similares al mRNA-seq pero con consideraciones especiales para la normalización, ya que los ARN pequeños tienen diferentes distribuciones de longitud y sesgos GC.
Aplicaciones
El perfilado de ARN pequeño ha revelado los roles reguladores generalizados de estas moléculas. Las firmas de miRNAs distinguen subtipos de cáncer y predicen la respuesta al tratamiento. Los miRNAs circulantes en sangre o suero sirven como biomarcadores mínimamente invasivos para enfermedades como cáncer, enfermedad cardiovascular y neurodegeneración. El análisis se conecta con estudios más amplios de estructura y tipos de ARN y regulación génica y epigenética, ya que muchos ARN pequeños participan en bucles reguladores con factores de transcripción y modificadores epigenéticos. Comprender la biogénesis de los ARN pequeños también se basa en conceptos de transcripción y procesamiento del ARN, particularmente el papel de Drosha y Dicer en la maduración de miRNAs.
