Das Hefe-Zwei-Hybrid-System detektiert Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen durch Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors. Es ist eine leistungsfähige und weit verbreitete Methode zur Entdeckung und Charakterisierung binärer Proteininteraktionen.

Prinzip

Das System basiert auf dem modularen Aufbau von Transkriptionsfaktoren, die trennbare DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen besitzen. Das interessierende Protein, der Köder, wird mit der DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors wie Gal4 fusioniert. Potenziell interagierende Proteine, die Beute, werden mit der Aktivierungsdomäne fusioniert. Die Interaktion zwischen Köder und Beute bringt die Aktivierungsdomäne in die Nähe der DNA-Bindungsdomäne und rekonstituiert einen funktionellen Transkriptionsfaktor, der die Reportergenexpression aktiviert.

Komponenten

Der Köder wird typischerweise in einen Vektor kloniert, der das Köderprotein fusioniert mit der Gal4-DNA-Bindungsdomäne exprimiert. Die Beute wird von einem Bibliotheksvektor aus exprimiert, der mit der Gal4-Aktivierungsdomäne fusioniert ist. Beide Plasmide werden in einen Hefe-Reporterstamm transformiert, der ein oder mehrere Reportergene unter der Kontrolle von Gal4-responsiven upstream-aktivierenden Sequenzen enthält.

Zu den Reportergenen gehören häufig HIS3, das Wachstum auf Histidin-Mangelmedium ermöglicht, ADE2 für die Adeninbiosynthese und lacZ oder GFP für kolorimetrische oder fluoreszenzbasierte Detektion. Mehrere Reporter mit verschiedenen Promotoren reduzieren falsch-positive Ergebnisse. Gegen-selektierbare Marker wie URA3 und CYH2 können falsch-positive Ergebnisse durch negative Selektion unter bestimmten Bedingungen eliminieren.

Bibliotheks-Screening

Ein typischer Y2H-Screen beginnt mit der Konstruktion einer cDNA-Bibliothek im Beutevektor. Der Köder wird in den Hefe-Reporterstamm transformiert und die Beute-Bibliothek wird durch groß angelegte Transformation eingeführt. Transformanten werden auf selektivem Medium plattiert, das Interaktion für das Wachstum erfordert. Kolonien, die nach 3 bis 7 Tagen erscheinen, werden aufgenommen und die Beute-Plasmide werden isoliert und sequenziert, um das interagierende Protein zu identifizieren.

Das Screening erfordert sorgfältige Optimierung. Der Köder muss auf Autoaktivierung getestet werden, bei der der Köder allein die Reportertranskription aktiviert. Wenn Autoaktivierung auftritt, kann der Köder verkürzt oder alternative Vektoren verwendet werden. Das Expressionsniveau von sowohl Köder als auch Beute beeinflusst die Empfindlichkeit. Hochdurchsatz-Screens mit Automatisierung und Pooling-Strategien ermöglichen die Kartierung von Interaktionen auf Proteomebene.

Vorteile und Einschränkungen

Y2H detektiert direkte, binäre Interaktionen und kann schwache oder transiente Interaktionen identifizieren, die durch Co-Immunpräzipitation und andere biochemische Methoden der Proteinextraktion und -reinigung möglicherweise übersehen werden. Das System ist für den Hochdurchsatz skalierbar, kosteneffektiv und erfordert keine proteinspezifischen Antikörper. Interaktionen werden in einer eukaryotischen Zellumgebung detektiert.

Zu den Einschränkungen gehören falsch-positive Ergebnisse durch Autoaktivatoren, klebrige Proteine und zufällige Interaktionen. Falsch-negative Ergebnisse treten auf, wenn Proteine in Hefe nicht richtig falten, posttranslationale Modifikationen benötigen, die in Hefe fehlen, oder bei Überexpression toxisch sind. Membranproteine sind problematisch, da die nukleäre Lokalisierung des Systems mit Membranumgebungen inkompatibel ist. Varianten wie das Split-Ubiquitin-System adressieren einige dieser Einschränkungen.

Varianten

Mehrere Y2H-Varianten erweitern die Basistechnik. Das reverse Zwei-Hybrid-System detektiert die Unterbrechung von Interaktionen durch Screening auf Verlust der Reporterexpression, nützlich für die Identifizierung von Mutationen oder Wirkstoffen, die spezifische Interaktionen stören. Das Ein-Hybrid-System detektiert Protein-DNA-Interaktionen durch Fusion der DNA-Bindungsdomäne an einen bekannten Transkriptionsfaktor und Screening auf Aktivierung. Das Drei-Hybrid-System detektiert RNA-Protein-Interaktionen unter Verwendung eines hybriden RNA-Moleküls, das Köder und Beute verbindet.

Das Membran-Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet den Split-Ubiquitin-Ansatz, bei dem Köder und Beute mit Hälften von Ubiquitin fusioniert werden. Interaktion rekonstituiert vollständiges Ubiquitin, das durch ubiquitinspezifische Proteasen gespalten wird, wodurch ein Transkriptionsfaktor freigesetzt wird, der Reportergene aktiviert. Dies ermöglicht die Detektion von Interaktionen mit Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung.

Anwendungen

Y2H wurde verwendet, um Interaktionskarten auf Proteomebene für Organismen einschließlich Hefe, Fliege, Wurm und Mensch zu erstellen. Diese Karten zeigen funktionelle Module auf, identifizieren neue Wegkomponenten und sagen Funktionen uncharakterisierter Proteine voraus. Y2H-Screens haben krankheitsrelevante Interaktionen identifiziert, wie Interaktionen zwischen Proteinen, die von Genen kodiert werden, die mit genetischen Störungen verbunden sind. Die Technologie wurde auch angewendet, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu kartieren und aufzuzeigen, wie virale und bakterielle Proteine die zelluläre Maschinerie des Wirts untergraben.