Proteinextraktion und -reinigung sind wesentliche Techniken zur Isolierung eines bestimmten Proteins aus einer komplexen Mischung zellulärer Komponenten. Gereinigte Proteine werden für Strukturstudien, Enzymtests, Antikörperproduktion und therapeutische Anwendungen benötigt.
Wie die Proteinextraktion und -reinigung funktioniert
- Zelllyse
Der erste Schritt besteht darin, die Zellen aufzubrechen, um ihren Inhalt freizugeben. Dies geschieht durch mechanische Methoden wie Homogenisierung, Ultraschallbehandlung oder Perlenschlagen, oft in Gegenwart eines Lysepuffers, der Proteaseinhibitoren enthält, um den Proteinabbau zu verhindern.
- Klarstellung
Das Lysat wird zentrifugiert, um unlösliche Ablagerungen, einschließlich Zellmembranen und Organellen, zu pelletieren. Der Überstand, der die löslichen Proteine enthält, wird gesammelt. Dieses geklärte Lysat ist das Ausgangsmaterial für die Reinigung.
- Fällung oder Fraktionierung
Manchmal wird ein erster Anreicherungsschritt verwendet. Durch die Ammonsulfatfällung werden Proteine aufgrund ihrer Löslichkeit selektiv ausgefällt. Durch Differenzzentrifugation können Proteine in einem Dichtegradienten nach Größe getrennt werden.
- Chromatographie
Die leistungsstärkste Reinigungsmethode ist die Säulenchromatographie, die Proteine anhand verschiedener Eigenschaften trennt:
- Affinitätschromatographie: Ein spezifischer Ligand oder Antikörper auf der Säule bindet das Zielprotein.
- Ionenaustauschchromatographie: Proteine werden anhand ihrer Nettoladung getrennt.
- Größenausschlusschromatographie: Proteine werden nach ihrer Größe und Form getrennt.
- Elution und Sammlung
Das Zielprotein wird von der Säule freigesetzt, indem die Pufferbedingungen geändert werden – Salzkonzentration, pH-Wert oder Zugabe eines konkurrierenden Liganden. Das gereinigte Protein wird in Fraktionen gesammelt und auf Reinheit analysiert.
- Qualitätskontrolle
Das gereinigte Protein wird mittels SDS-PAGE oder Kapillargelelektrophorese (CGE) analysiert, um seine Größe und Reinheit zu überprüfen. Western Blot bestätigt seine Identität. Die Konzentration wird mithilfe eines Proteinquantifizierungstests gemessen.
Praktisches Protokoll zur Proteinextraktion und His-Tag-Reinigung
Ernten Sie Zellen (1 × 10⁷ Säugetierzellen oder 50 ml Bakterienkultur) durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 × g. Waschen Sie das Pellet mit eiskaltem PBS. In 500 µL RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % Triton Für Bakterienzellen, die ein His-markiertes Protein exprimieren, verwenden Sie einen denaturierenden Lysepuffer (8 M Harnstoff, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) oder nativen Puffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0). Zellen durch Ultraschall auf Eis lysieren: 3 Impulse von 15 Sekunden bei 30 % Amplitude mit 30-Sekunden-Kühlintervallen. Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 × g und sammeln Sie den Überstand. Äquilibrieren Sie 1 ml Ni-NTA-Agaroseharz in einer Schwerkraftsäule mit 10 Säulenvolumina Bindungspuffer. Tragen Sie das geklärte Lysat auf und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie mit 10 Säulenvolumina Waschpuffer (Bindungspuffer mit 20–50 mM Imidazol). Eluieren Sie das His-markierte Protein in 5 × 1 ml-Fraktionen mit Elutionspuffer (Bindungspuffer mit 250 mM Imidazol). Analysieren Sie 20 µL jeder Fraktion (Lysat, Durchfluss, Waschen, Elutionen) durch 12 % SDS-PAGE. Färben Sie mit Coomassie Blue, um das Zielprotein sichtbar zu machen – eine einzelne Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht in Elutionsfraktionen zeigt eine erfolgreiche Reinigung an. Um eine höhere Reinheit zu erzielen, bündeln Sie die Elutionsfraktionen und lassen Sie sie auf einer Größenausschlusschromatographiesäule (Superdex 200) laufen, die mit Lagerpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin) äquilibriert ist.
Reale Anwendung
Eine 6×His-markierte menschliche Kinase (MAPK14/p38α, 41 kDa) wird in E. coli BL21(DE3) mit 0,5 mM IPTG-Induktion für 4 Stunden bei 30 °C exprimiert. Nach der Ni-NTA-Reinigung zeigt die SDS-PAGE eine deutliche 41-kDa-Bande in Elutionsfraktionen mit einer Reinheit von >90 %. Das Protein wird auf 5 mg/ml konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und behält in einem Phosphorylierungstest eine Kinaseaktivität von >80 %.
