EMSA y la huella de ADN son métodos clásicos para estudiar interacciones proteína-ADN. EMSA detecta la unión y mide la afinidad, mientras que la huella identifica los nucleótidos específicos que son contactados por la proteína de unión.

Ensayo de Cambio de Movilidad Electroforética

EMSA, también llamado ensayo de cambio en gel, se basa en la observación de que los complejos proteína-ADN migran más lentamente a través de un gel de poliacrilamida nativo que el ADN libre, similar a la electroforesis en gel de agarosa. Una sonda de ADN radiomarcada o marcada fluorescentemente que contiene el sitio de unión putativo se incuba con un extracto de proteínas o proteína purificada. La mezcla se separa mediante electroforesis en gel nativo. El ADN libre corre más rápido, mientras que el ADN unido a proteína se desplaza a una posición más alta en el gel.

EMSA es altamente sensible y puede detectar interacciones en mezclas complejas. La especificidad se demuestra mediante competencia con ADN específico y no específico no marcado. El exceso de ADN específico no marcado elimina la banda desplazada, mientras que el competidor no específico no lo hace. Los ensayos de superdesplazamiento usan anticuerpos contra la proteína de unión para retardar aún más el complejo, confirmando la identidad de la proteína.

Afinidad de Unión y Estequiometría

EMSA puede medir la afinidad de unión titulando la concentración de proteína y cuantificando la fracción de ADN unido. La constante de disociación en equilibrio se determina a partir de la concentración de proteína en la unión media máxima. Múltiples bandas desplazadas pueden revelar diferentes complejos estequiométricos o múltiples sitios de unión. La unión cooperativa se detecta cuando la curva de unión es sigmoidea en lugar de hiperbólica.

Diseño de Sondas

Las sondas de ADN para EMSA son típicamente de 20 a 40 pares de bases que contienen el sitio de unión. Las sondas de doble cadena se preparan hibridando oligonucleótidos complementarios y marcando los extremos con fósforo-32 radiactivo o tintes fluorescentes. Se pueden usar sondas más largas de varios cientos de pares de bases para mapear regiones cis-reguladoras. Las sondas marcadas con biotina con detección quimioluminiscente, como se usa en Southern blot, proporcionan una alternativa no radiactiva.

Huella con DNasa I

La huella con DNasa I identifica los nucleótidos específicos protegidos por una proteína unida. Un fragmento de ADN marcado en un extremo se incuba con la proteína de unión y luego se digiere parcialmente con DNasa I. La nucleasa corta el ADN no protegido de forma estocástica, pero la región unida por la proteína está protegida de la escisión. Los productos de digestión se separan mediante electroforesis en gel desnaturalizante junto con una escalera de secuenciación.

El patrón de protección aparece como un hueco en la escalera de bandas, la huella. Los límites de la huella definen el sitio de unión de la proteína con resolución de nucleótidos. Los sitios hipersensibles, donde DNasa I corta con más frecuencia, a menudo se ven en los bordes de la huella e indican curvatura del ADN inducida por la unión de la proteína.

Huella con Radical Hidroxilo

La huella con radical hidroxilo usa el radical hidroxilo altamente reactivo para escindir el esqueleto del ADN en cada posición con poco sesgo de secuencia. El radical se genera mediante la reacción de Fenton usando hierro-EDTA, ascorbato y peróxido de hidrógeno. Debido a que el radical es más pequeño que la DNasa I, la huella con radical hidroxilo proporciona mayor resolución, detectando contactos en caras individuales de nucleótidos. Es particularmente útil para analizar la periodicidad de las interacciones proteína-ADN a lo largo de una hélice de ADN.

Enfoques In Vivo

La huella in vivo usa agentes que modifican el ADN en células vivas. El sulfato de dimetilo metila residuos de guanina que no están protegidos por proteínas unidas. Después del tratamiento, el ADN se aísla, se escinde en sitios metilados y se analiza mediante PCR mediada por ligación. La comparación de patrones in vivo e in vitro revela qué sitios de unión están ocupados en la célula. Los ensayos de accesibilidad de cromatina como DNase-seq y ATAC-seq proporcionan vistas genómicas de la cromatina abierta pero con menor resolución que la huella.

Aplicaciones

EMSA se usa para confirmar sitios de unión de factores de transcripción predichos, caracterizar sitios de unión mutantes, estudiar interacciones cooperativas y monitorear la actividad de unión durante la purificación. La huella identifica la secuencia exacta de ADN reconocida por una proteína y revela cambios conformacionales inducidos por la unión.

Limitaciones

EMSA requiere complejos relativamente estables que sobrevivan la electroforesis. Los complejos que se disocian rápidamente pueden no detectarse. La matriz del gel puede estabilizar interacciones débiles pero también crear artefactos por efectos de confinamiento. Ambas técnicas requieren sondas de ADN purificadas y no son adecuadas para análisis de alto rendimiento. El EMSA cuantitativo requiere un control cuidadoso de la actividad específica de la sonda y la linealidad de la detección.