La spectroscopie de fluorescence est une technique analytique qui mesure l’émission de lumière par des molécules après excitation par des photons. Elle est très sensible (limites de détection jusqu’au pM), sélective et largement utilisée en biochimie, analyse environnementale et science des matériaux.

Principes de la Fluorescence

Une molécule absorbe un photon et est promue de l’état fondamental (S0) à un état singulet excité (S1 ou S2). La conversion interne relaxe rapidement la molécule au niveau vibrationnel le plus bas de S1 (règle de Kasha). La fluorescence se produit lorsque la molécule retourne à S0 en émettant un photon, et la lumière émise a une longueur d’onde plus longue (énergie plus faible) que la lumière absorbée, un phénomène connu sous le nom de déplacement de Stokes. Ce déplacement provient de la perte d’énergie par relaxation vibrationnelle et réorganisation du solvant, et un grand déplacement de Stokes (20-100 nm) permet la séparation de la lumière d’excitation et d’émission par des filtres ou des monochromateurs. Le diagramme de Jablonski illustre ces processus photophysiques : absorption, conversion interne, fluorescence, croisement intersystème et phosphorescence.

Paramètres de Fluorescence

Les paramètres clés de la fluorescence incluent le rendement quantique, la durée de vie et l’intensité. Le rendement quantique (Φ) est le rapport des photons émis aux photons absorbés (Φ = kémi/kabsorbé), avec des valeurs allant de moins de 0,01 (faiblement fluorescent) à près de 1,0 (hautement fluorescent, par exemple, fluorescéine à pH 9, Φ = 0,95). La durée de vie (τ) est le temps moyen qu’une molécule passe dans l’état excité avant d’émettre un photon, typiquement 1-10 ns pour les fluorophores organiques. L’intensité de fluorescence suit I = I0 × (1 - 10-εbc) × Φ, où ε est l’absorptivité molaire, b est le trajet optique et c est la concentration ; à faibles concentrations, l’intensité est proportionnelle à la concentration.

Fluorophores

Les fluorophores sont classés comme intrinsèques ou extrinsèques. Les fluorophores intrinsèques sont des molécules fluorescentes naturelles telles que les acides aminés aromatiques (tryptophane, λex ~280 nm, λem ~350 nm), le NADH, les flavines et la chlorophylle. Les fluorophores extrinsèques sont des colorants synthétiques ajoutés aux échantillons non fluorescents, incluant la fluorescéine (λex 494 nm, λem 518 nm), la rhodamine, les colorants cyanine (Cy3, Cy5) et la série Alexa Fluor. Les points quantiques sont des nanocristaux semiconducteurs avec une émission ajustable par taille, une excitation large, une émission étroite et une haute photostabilité.

Instrumentation

Un spectromètre de fluorescence comprend une source de lumière telle qu’une lampe à arc au xénon (large spectre, 200-1000 nm) ou des LED pour les mesures stationnaires, et des lasers pulsés ou LED pour les mesures résolues dans le temps. Un monochromateur d’excitation sélectionne la longueur d’onde d’excitation, et un double monochromateur réduit la lumière diffusée pour les mesures de haute sensibilité. Le compartiment échantillon utilise une cuve en quartz à quatre faces claires pour la géométrie de détection à angle droit, ou une géométrie frontale pour les échantillons très absorbants ou diffusants. Un monochromateur d’émission balaie la longueur d’onde d’émission tandis qu’un filtre passe-long bloque la lumière d’excitation diffusée, et le détecteur est typiquement un tube photomultiplicateur (PMT) pour une haute sensibilité ou un CCD pour la détection multicanal.

Techniques de Fluorescence

Plusieurs techniques de fluorescence spécialisées existent. La fluorescence stationnaire mesure l’intensité d’émission à une longueur d’onde d’excitation fixe et est utilisée pour la détermination de concentration et la caractérisation du spectre d’émission. La fluorescence résolue dans le temps mesure la décroissance de fluorescence après une courte impulsion d’excitation et est utilisée pour déterminer les durées de vie de fluorescence, distinguer l’extinction dynamique de l’extinction statique et étudier la dynamique moléculaire. Le Transfert d’Énergie par Résonance de Fluorescence (FRET) implique un transfert d’énergie non radiatif d’un fluorophore donneur à un accepteur dans 1-10 nm, avec une efficacité proportionnelle à 1/r6, ce qui en fait une règle moléculaire pour les distances dans les protéines et les acides nucléiques. La polarisation de fluorescence (anisotropie) mesure la mobilité rotationnelle des fluorophores et est utilisée dans les études de liaison et les dosages immunologiques.

Extinction (Quenching)

L’extinction de fluorescence peut se produire par deux mécanismes. L’extinction dynamique (collisionnelle) se produit lorsqu’un extincteur tel que O2, I- ou l’acrylamide diffuse et entre en collision avec le fluorophore pendant l’état excité, décrite par l’équation de Stern-Volmer : F0/F = 1 + KSV[Q]. L’extinction statique se produit lorsque l’extincteur forme un complexe non fluorescent à l’état fondamental avec le fluorophore. Les deux mécanismes sont distingués par des mesures de durée de vie : l’extinction dynamique réduit la durée de vie tandis que l’extinction statique ne le fait pas.

Applications

La spectroscopie de fluorescence est utilisée pour l’analyse quantitative d’analytes fluorescents dans des échantillons pharmaceutiques et environnementaux, les dosages d’activité enzymatique utilisant des substrats fluorogènes, le séquençage d’ADN et l’analyse par puces à ADN utilisant des marqueurs fluorescents, l’imagerie cellulaire et la cytométrie en flux utilisant des anticorps et colorants fluorescents, et la surveillance environnementale de polluants tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques et les substances humiques.