L’immunohistochimie (IHC) est une technique qui visualise des antigènes spécifiques dans les coupes tissulaires en utilisant des anticorps conjugués à des marqueurs détectables. Elle fait le pont entre la morphologie et l’identité moléculaire, permettant aux pathologistes de voir non seulement à quoi ressemblent les cellules mais aussi quelles protéines elles expriment. L’IHC est devenue indispensable en pathologie diagnostique, en particulier pour la classification tumorale et les tests de biomarqueurs prédictifs.
Types d’Anticorps
Les anticorps polyclonaux sont produits en immunisant un animal (lapin, chèvre) avec l’antigène cible ; le sérum résultant contient un mélange d’anticorps reconnaissant différents épitopes. Ils ont une sensibilité élevée mais une spécificité plus faible et une variabilité lot à lot.
Les anticorps monoclonaux sont produits par un seul clone de cellule B fusionné avec une cellule de myélome pour créer un hybridome. Ils reconnaissent un seul épitope, offrant une spécificité élevée et des performances reproductibles. Les anticorps monoclonaux de souris étaient historiquement la norme, mais les anticorps monoclonaux de lapin dominent maintenant car ils offrent une meilleure sensibilité grâce à une affinité plus élevée et à la liaison à des épitopes plus diversifiés.
Les anticorps recombinants sont conçus à partir de gènes d’anticorps séquencés, éliminant l’immunisation animale. Ils offrent une cohérence inégalée et peuvent être conçus pour des formats spécifiques (fragments Fab, variants à chaîne unique, anticorps bispécifiques).
Systèmes de Détection
L’IHC directe utilise un anticorps primaire conjugué directement à un marqueur (enzyme ou fluorophore). C’est simple et rapide mais manque de sensibilité car un seul anticorps marqué se lie par antigène.
L’IHC indirecte utilise un anticorps primaire non marqué détecté par un anticorps secondaire marqué qui cible la région Fc spécifique à l’espèce de l’anticorps primaire. L’amplification par de multiples anticorps secondaires se liant par anticorps primaire augmente la sensibilité.
La détection à base de polymères utilise un squelette polymère (dextran ou similaire) conjugué à de multiples anticorps secondaires et à de multiples molécules enzymatiques. Cela fournit une forte amplification du signal sans les problèmes de bruit de fond des systèmes avidine-biotine.
Les méthodes du complexe avidine-biotine (ABC) exploitent la haute affinité de l’avidine (ou streptavidine) pour la biotine. Un anticorps secondaire biotinylé est détecté par un complexe préformé d’avidine et d’enzyme biotinylée. Bien que sensible, la biotine endogène dans les tissus (foie, rein, cerveau) peut provoquer une coloration de fond.
Chromogènes et Fluorophores
DAB (3,3’-diaminobenzidine) produit un précipité brun insoluble au site de l’antigène cible. Il est résistant à l’alcool et permanent, ce qui en fait le chromogène le plus utilisé pour l’IHC à champ clair.
Fast Red et AEC produisent des précipités rouges qui sont solubles dans l’alcool, nécessitant des milieux de montage aqueux. Ils sont utiles pour la double IHC lorsqu’ils sont combinés avec le DAB.
Les fluorophores (FITC, TRITC, colorants Alexa) permettent l’immunofluorescence multi-marqueurs avec séparation spectrale, permettant la visualisation simultanée de multiples antigènes.
Démasquage Antigénique
La fixation au formol crée des ponts méthylène qui masquent de nombreux épitopes, les rendant inaccessibles aux anticorps. Le démasquage antigénique par chaleur (HIER) utilise un micro-ondes, un autocuiseur ou un bain-marie pour chauffer les coupes dans un tampon citrate (pH 6,0) ou un tampon Tris-EDTA (pH 9,0) pendant 20-40 minutes, brisant les réticulations et restaurant l’antigénicité. Le démasquage enzymatique utilise des protéases (trypsine, protéinase K, pepsine) pour les antigènes sensibles à la chaleur. Le choix de la méthode de démasquage est spécifique à l’anticorps et est optimisé lors de la validation IHC.
Contrôles et Interprétation
Chaque série IHC doit inclure un contrôle positif (tissu connu pour exprimer l’antigène cible à l’intensité et la localisation attendues — nucléaire, cytoplasmique ou membranaire) et un contrôle négatif (même tissu traité sans anticorps primaire). Les contrôles positifs internes (cellules non néoplasiques dans la même coupe qui devraient exprimer l’antigène) fournissent une validation supplémentaire. La coloration est interprétée comme positive ou négative en faisant attention à la localisation subcellulaire — un anticorps censé montrer une coloration nucléaire (ER, Ki-67) qui montre une coloration cytoplasmique est probablement non spécifique.
