Imunohistokimia (IHC) adalah teknik yang memvisualisasikan antigen spesifik dalam irisan jaringan menggunakan antibodi yang dikonjugasi ke label yang dapat dideteksi. Ini menjembatani morfologi dan identitas molekuler, memungkinkan patolog melihat tidak hanya bagaimana bentuk sel tetapi protein apa yang mereka ekspresikan. IHC telah menjadi sangat diperlukan dalam patologi diagnostik, terutama untuk klasifikasi tumor dan pengujian biomarker prediktif.
Jenis Antibodi
Antibodi poliklonal diproduksi dengan mengimunisasi hewan (kelinci, kambing) dengan antigen target; serum yang dihasilkan mengandung campuran antibodi yang mengenali epitop berbeda. Mereka memiliki sensitivitas tinggi tetapi spesifisitas lebih rendah dan variabilitas batch-ke-batch.
Antibodi monoklonal diproduksi oleh klon sel B tunggal yang difusikan dengan sel mieloma untuk membuat hibridoma. Mereka mengenali satu epitop, memberikan spesifisitas tinggi dan kinerja yang reprodusibel. Antibodi monoklonal mencit secara historis adalah standar, tetapi antibodi monoklonal kelinci kini mendominasi karena menawarkan sensitivitas lebih baik karena afinitas lebih tinggi dan pengikatan ke epitop yang lebih beragam.
Antibodi rekombinan direkayasa dari gen antibodi yang telah diurutkan, menghilangkan imunisasi hewan. Mereka menawarkan konsistensi yang tak tertandingi dan dapat dirancang untuk format spesifik (fragmen Fab, varian rantai tunggal, antibodi bispesifik).
Sistem Deteksi
IHC langsung menggunakan antibodi primer yang dikonjugasi langsung ke label (enzim atau fluorofor). Ini sederhana dan cepat tetapi kurang sensitif karena hanya satu antibodi berlabel yang berikatan per antigen.
IHC tidak langsung menggunakan antibodi primer tanpa label yang dideteksi oleh antibodi sekunder berlabel yang menargetkan daerah Fc spesifik spesies antibodi primer. Amplifikasi dari beberapa antibodi sekunder yang berikatan per primer meningkatkan sensitivitas.
Deteksi berbasis polimer menggunakan tulang punggung polimer (dekstran atau sejenisnya) yang dikonjugasi ke beberapa antibodi sekunder dan beberapa molekul enzim. Ini memberikan amplifikasi sinyal yang kuat tanpa masalah latar belakang dari sistem avidin-biotin.
Metode kompleks avidin-biotin (ABC) memanfaatkan afinitas tinggi avidin (atau streptavidin) untuk biotin. Antibodi sekunder biotinilasi dideteksi oleh kompleks avidin dan enzim biotinilasi yang sudah terbentuk. Meskipun sensitif, biotin endogen dalam jaringan (hati, ginjal, otak) dapat menyebabkan pewarnaan latar belakang.
Kromogen dan Fluorofor
DAB (3,3’-diaminobenzidine) menghasilkan endapan coklat tak larut di lokasi antigen target. Ini tahan alkohol dan permanen, menjadikannya kromogen yang paling banyak digunakan untuk IHC medan terang.
Fast Red dan AEC menghasilkan endapan merah yang larut dalam alkohol, memerlukan media mounting berair. Mereka berguna untuk IHC ganda bila dikombinasikan dengan DAB.
Fluorofor (FITC, TRITC, Alexa dyes) memungkinkan imunofluoresensi multi-label dengan pemisahan spektral, memungkinkan visualisasi simultan beberapa antigen.
Pengambilan Kembali Antigen
Fiksasi formalin menciptakan ikatan-silang jembatan metilen yang menutupi banyak epitop, membuatnya tidak dapat diakses oleh antibodi. Pengambilan epitop induksi panas (HIER) menggunakan microwave, pressure cooker, atau penangas air untuk memanaskan irisan dalam buffer sitrat (pH 6,0) atau buffer Tris-EDTA (pH 9,0) selama 20-40 menit, memutus ikatan-silang dan mengembalikan antigenisitas. Pengambilan enzimatik menggunakan protease (tripsin, proteinase K, pepsin) untuk antigen yang sensitif terhadap panas. Pilihan metode pengambilan spesifik untuk antibodi dan dioptimalkan selama validasi IHC.
Kontrol dan Interpretasi
Setiap proses IHC harus menyertakan kontrol positif (jaringan yang diketahui mengekspresikan antigen target pada intensitas dan lokalisasi yang diharapkan — inti, sitoplasma, atau membran) dan kontrol negatif (jaringan yang sama diproses tanpa antibodi primer). Kontrol positif internal (sel non-neoplastik dalam irisan yang sama yang seharusnya mengekspresikan antigen) memberikan validasi tambahan. Pewarnaan diinterpretasikan sebagai positif atau negatif dengan perhatian pada lokalisasi subseluler — antibodi yang diharapkan menunjukkan pewarnaan inti (ER, Ki-67) yang menunjukkan pewarnaan sitoplasma kemungkinan non-spesifik.
