Die Immunhistochemie (IHC) ist eine Technik, die spezifische Antigene in Gewebeschnitten mit Hilfe von Antikörpern sichtbar macht, die an nachweisbare Marker gekoppelt sind. Sie verbindet Morphologie und molekulare Identität und ermöglicht Pathologen nicht nur zu sehen, wie Zellen aussehen, sondern auch welche Proteine sie exprimieren. Die IHC ist in der diagnostischen Pathologie unverzichtbar geworden, insbesondere für die Tumorklassifikation und den Nachweis prädiktiver Biomarker.

Antikörpertypen

Polyklonale Antikörper werden durch Immunisierung eines Tiers (Kaninchen, Ziege) mit dem Zielantigen hergestellt; das resultierende Serum enthält eine Mischung von Antikörpern, die verschiedene Epitope erkennen. Sie haben eine hohe Sensitivität, aber geringere Spezifität und Chargenvarianz.

Monoklonale Antikörper werden von einem einzelnen B-Zell-Klon produziert, der mit einer Myelomzelle zu einem Hybridom fusioniert wurde. Sie erkennen ein einzelnes Epitop und bieten hohe Spezifität und reproduzierbare Leistung. Ursprünglich dominerten monoklonale Maus-Antikörper, aber monoklonale Kaninchen-Antikörper sind heute vorherrschend, da sie aufgrund höherer Affinität und Bindung an vielfältigere Epitope eine bessere Sensitivität bieten.

Rekombinante Antikörper werden aus sequenzierten Antikörpergenen hergestellt, wodurch die Tierimmunisierung entfällt. Sie bieten beispiellose Konsistenz und können für spezifische Formate (Fab-Fragmente, Einzelkettenvarianten, bispezifische Antikörper) entwickelt werden.

Detektionssysteme

Direkte IHC verwendet einen Primärantikörper, der direkt an einen Marker (Enzym oder Fluorophor) konjugiert ist. Sie ist einfach und schnell, aber wenig sensitiv, da nur ein markierter Antikörper pro Antigen bindet.

Indirekte IHC verwendet einen unmarkierten Primärantikörper, der durch einen markierten Sekundärantikörper nachgewiesen wird, der gegen die Spezies-spezifische Fc-Region des Primärantikörpers gerichtet ist. Die Amplifikation durch mehrere Sekundärantikörper pro Primärantikörper erhöht die Sensitivität.

Polymerbasierte Detektion verwendet ein Polymerrückgrat (Dextran oder ähnlich), das mit mehreren Sekundärantikörpern und mehreren Enzymmolekülen konjugiert ist. Dies bietet eine starke Signalverstärkung ohne die Hintergrundprobleme von Avidin-Biotin-Systemen.

Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methoden nutzen die hohe Affinität von Avidin (oder Streptavidin) zu Biotin. Ein biotinylierter Sekundärantikörper wird durch einen vorgeformten Komplex aus Avidin und biotinyliertem Enzym nachgewiesen. Endogenes Biotin in Geweben (Leber, Niere, Gehirn) kann jedoch Hintergrundfärbung verursachen.

Chromogene und Fluorophore

DAB (3,3’-Diaminobenzidin) erzeugt einen braunen, unlöslichen Niederschlag am Ort des Zielantigens. Es ist alkoholbeständig und permanent, was es zum am weitesten verbreiteten Chromogen für die Hellfeld-IHC macht.

Fast Red und AEC erzeugen rote Niederschläge, die alkohollöslich sind und wässrige Einbettmedien erfordern. Sie sind nützlich für Doppel-IHC in Kombination mit DAB.

Fluorophore (FITC, TRITC, Alexa-Farbstoffe) ermöglichen die Mehrfach-Immunfluoreszenz mit spektraler Trennung zur gleichzeitigen Visualisierung mehrerer Antigene.

Antigendemaskierung

Die Formalinfixierung erzeugt Methylenbrücken-Quervernetzungen, die viele Epitope maskieren und für Antikörper unzugänglich machen. Die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung (HIER) verwendet eine Mikrowelle, einen Schnellkochtopf oder ein Wasserbad, um Schnitte in Citratpuffer (pH 6,0) oder Tris-EDTA-Puffer (pH 9,0) für 20-40 Minuten zu erhitzen, wodurch Quervernetzungen aufgebrochen und die Antigenität wiederhergestellt wird. Die enzymatische Demaskierung verwendet Proteasen (Trypsin, Proteinase K, Pepsin) für hitzeempfindliche Antigene. Die Wahl der Demaskierungsmethode ist antikörperspezifisch und wird bei der IHC-Validierung optimiert.

Kontrollen und Interpretation

Jeder IHC-Durchlauf muss eine Positivkontrolle (Gewebe, das bekanntermaßen das Zielantigen in der erwarteten Intensität und Lokalisation exprimiert — nukleär, zytoplasmatisch oder membranös) und eine Negativkontrolle (gleiches Gewebe ohne Primärantikörper) enthalten. Interne Positivkontrollen (nicht-neoplastische Zellen im selben Schnitt, die das Antigen exprimieren sollten) bieten zusätzliche Validierung. Die Färbung wird als positiv oder negativ interpretiert, wobei auf die subzelluläre Lokalisation geachtet wird — ein Antikörper, der nukleäre Färbung zeigen sollte (ER, Ki-67), aber zytoplasmatische Färbung aufweist, ist wahrscheinlich unspezifisch.