Die Immunhistochemie ist eine mehrstufige Technik, bei der jede Variable das Endergebnis beeinflussen kann. Wenn die IHC fehlschlägt – sei es aufgrund einer schwachen Färbung, eines übermäßigen Hintergrunds oder unerwarteter Muster –, identifiziert ein systematischer Ansatz die Ursache. Strenge Kontrollen und Optimierungsprotokolle minimieren Fehler und gewährleisten eine zuverlässige diagnostische und prädiktive IHC.

Kontrollen: Die Grundlage der IHC-Qualität

Jeder IHC-Lauf umfasst drei wesentliche Kontrollen. Die Positivkontrolle ist ein Gewebe, von dem bekannt ist, dass es das Zielantigen in der erwarteten Intensität und subzellulären Lokalisierung (nuklear, zytoplasmatisch oder membranös) exprimiert. Im Idealfall handelt es sich bei der Positivkontrolle um einen Gewebeblock, der genauso verarbeitet wird wie das Testgewebe – gleiches Fixiermittel, gleicher Verarbeitungsplan, gleiches Blockalter. Für prädiktive Marker (ER, HER2, PD-L1) werden Zelllinienkontrollen mit bekannten Expressionsniveaus empfohlen.

Bei der Negativkontrolle handelt es sich um dasselbe positive Kontrollgewebe, das ohne Primärantikörper (oder mit nicht-immunem Immunglobulin derselben Art und Konzentration) verarbeitet wurde. Jede Färbung in der Negativkontrolle weist auf eine unspezifische Bindung des Nachweissystems oder eine endogene Enzymaktivität hin.

Die interne Positivkontrolle ist ein nicht-neoplastischer Zelltyp innerhalb des Testabschnitts, der das Zielantigen exprimieren sollte. Beispielsweise dienen Lymphozyten als interne Positivkontrollen für CD45; Endothelzellen für CD31; normale Brustgänge für die Notaufnahme. Der Verlust der internen Kontrolle deutet eher auf ein technisches Versagen als auf ein echtes Fehlen des Antigens hin.

Schwache oder fehlende Färbung

Eine schwache oder fehlende Färbung, wenn positive Kontrollen versagen, erfordert eine systematische Überprüfung. Ab Beginn des Protokolls: Gewebefixierung – Überfixierung (>72 Stunden) kann Antigene irreversibel maskieren; Eine Unterfixierung (<4 Stunden) ermöglicht die Antigendiffusion. Rufen Sie archivierte Blöcke mit bekanntermaßen positiven Ergebnissen ab, um Fixierungen von Verarbeitungsproblemen zu unterscheiden. Antigen-Retrieval – Erhöhen Sie die HIER-Zeit oder -Temperatur, wechseln Sie zu einem Puffer mit höherem pH-Wert (Tris-EDTA pH 9,0 statt Citrat pH 6,0) oder versuchen Sie es mit der enzymatischen Retrieval. Antikörper – Stellen Sie sicher, dass der Antikörper nicht abgelaufen ist, keinen Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen wurde und die richtige Verdünnung aufweist. Titrieren Sie den Primärantikörper in Reihenverdünnungen (1:50, 1:100, 1:200, 1:400), um die optimale Konzentration zu finden. Nachweissystem – Überprüfen Sie, ob der sekundäre Antikörper mit der primären Spezies übereinstimmt; Stellen Sie sicher, dass das Chromogen (DAB) frisch ist und das Wasserstoffperoxid nicht abgebaut wurde.

Übermäßiger Hintergrund

Hintergrundfärbungen verdecken spezifische Signale und können zu falschen Interpretationen führen. Endogene Peroxidase-Aktivität (in Erythrozyten, Neutrophilen) wird durch eine Vorbehandlung mit 3 % Wasserstoffperoxid für 10–15 Minuten blockiert. Endogenes Biotin in Leber-, Nieren- und Gehirngeweben verursacht einen Hintergrund bei Avidin-Biotin-Nachweissystemen – wechseln Sie zur Detektion auf Polymerbasis, um dies zu vermeiden. Primäre Antikörperkonzentration zu hoch – titrieren Sie, bis sich der Hintergrund auflöst, während das spezifische Signal erhalten bleibt. Inkubationszeit oder Temperatur zu hoch – Reduzieren Sie die Inkubation des Primärantikörpers von 60 Minuten auf 30 Minuten bei Raumtemperatur oder von über Nacht bei 4 °C auf 60 Minuten. Unzureichendes Waschen – Erhöhen Sie das Waschpuffervolumen, die Anzahl der Waschvorgänge und die Waschzeit (mindestens 3 x 5 Minuten in PBS oder TBS). Getrocknete Schnitte – wenn der Gewebeschnitt zu irgendeinem Zeitpunkt trocknet, binden Antikörper unspezifisch; Stellen Sie sicher, dass die Schnitte durchgehend mit Reagenz bedeckt bleiben.

Falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse

Ein falsch positives Ergebnis (Färbung dort, wo Antigen fehlt) kann durch Antikörper-Kreuzreaktivität entstehen – der Antikörper erkennt ein anderes Protein mit einem ähnlichen Epitop. Überprüfen Sie das Antikörperdatenblatt auf bekannte Kreuzreaktivitäten und bestätigen Sie dies mit einem anderen Antikörperklon. Kantenartefakte (Flecken an den Geweberändern) entstehen durch Austrocknung oder ungleichmäßige Schnitthaftung – stellen Sie eine vollständige Abdeckung und eine ordnungsgemäße Schnittmontage sicher.

Ein falsch negatives Ergebnis (keine Färbung dort, wo Antigen vorhanden ist) resultiert meist aus einer unzureichenden Antigengewinnung für die spezifischen Fixierungsbedingungen. Antigenabbau in alten Blöcken oder Schnitten, die lange vor der Färbung geschnitten wurden, erfordert eine stärkere Entnahme oder Verwendung frisch geschnittener Schnitte. Primärer Antikörper wird vom Erkennungssystem nicht erkannt – Speziesspezifität des sekundären Antikörpers überprüfen.

Optimierungsprotokoll für neue Antikörper

Führen Sie bei der Einführung eines neuen Antikörpers eine Titermatrix durch, bei der vier primäre Antikörperverdünnungen anhand von vier Retrievalbedingungen (Citrat pH 6,0 HIER, Tris-EDTA pH 9,0 HIER, Proteinase K, keine Retrieval) an einem bekannten positiven Kontrollgewebe getestet werden. Bewerten Sie jede Kombination hinsichtlich Intensität (0–3+), Prozentsatz positiver Zellen und Hintergrund (0–3+). Wählen Sie die Verdünnungs-Retrieval-Kombination aus, die das stärkste spezifische Signal bei minimalem Hintergrund liefert. Dokumentieren Sie das optimierte Protokoll und nehmen Sie es in die Qualitätssicherung Aufzeichnungen des Labors auf.

Automatisierte IHC-Validierung

Automatisierte IHC-Plattformen (Ventana, Dako, Leica) verbessern die Reproduzierbarkeit, erfordern jedoch beim Übergang von manuellen Methoden eine Protokollvalidierung. Führen Sie denselben Validierungssatz (mindestens 10 positive und 10 negative Fälle) sowohl auf der manuellen als auch auf der automatisierten Plattform aus. Vergleichen Sie Intensität, Prozentsatz, Lokalisierung und Hintergrund. Für die klinische Validierung ist typischerweise ein Konkordanzschwellenwert von 90 % erforderlich.