La protéomique est l’étude à grande échelle des protéines, de leurs structures, fonctions, interactions et modifications. Contrairement au génome, qui est relativement statique, le protéome est dynamique et reflète l’état de la cellule, avec l’expression, la localisation, la modification et le renouvellement des protéines tous sujets à régulation.

Principes de la Spectrométrie de Masse

La spectrométrie de masse mesure le rapport masse/charge des molécules ionisées. Un spectromètre de masse comporte trois composants essentiels. La source d’ions convertit les molécules en ions en phase gazeuse. L’analyseur de masse sépare les ions selon leur rapport masse/charge. Le détecteur mesure l’abondance de chaque ion. Les protéines et les peptides sont généralement analysés par ionisation par électrospray ou par ionisation laser assistée par matrice.

L’ionisation par électrospray produit des ions multichargés à partir de peptides en solution, générant une série de pics à partir desquels la masse moléculaire peut être calculée. La MALDI produit typiquement des ions monochargés à partir de peptides incorporés dans une matrice cristalline et désorbés par une impulsion laser. Ces deux méthodes sont des techniques d’ionisation douce qui préservent l’intégrité de l’analyte.

Analyseurs de Masse

Plusieurs types d’analyseurs de masse sont utilisés en protéomique. Les filtres de masse quadripolaires transmettent les ions d’un rapport masse/charge sélectionné à travers quatre tiges parallèles avec des champs électriques oscillants. Les analyseurs à temps de vol mesurent le temps mis par les ions pour parcourir une distance fixe, les ions plus légers arrivant plus rapidement. Les analyseurs Orbitrap piègent les ions dans un champ électrostatique et mesurent leurs fréquences d’oscillation, offrant une haute résolution et une grande précision de masse. Les analyseurs à piège ionique confinent les ions dans un champ électrique tridimensionnel et les éjectent séquentiellement. Les instruments hybrides combinant plusieurs types d’analyseurs, comme les instruments quadripôle-Orbitrap ou triple quadripôle, offrent une flexibilité pour différentes stratégies expérimentales.

Protéomique Ascendante

La protéomique ascendante analyse les protéines (souvent séparées par SDS-PAGE) après digestion en peptides, typiquement en utilisant la trypsine, qui clive après les résidus arginine et lysine. Le mélange peptidique résultant est séparé par chromatographie liquide et analysé par spectrométrie de masse en tandem. En acquisition dépendante des données, le spectromètre de masse sélectionne les ions peptidiques les plus abondants pour fragmentation par dissociation induite par collision. Les spectres d’ions fragments résultants sont recherchés dans des bases de données de séquences protéiques pour identifier les peptides et leurs protéines parentes.

Spectrométrie de Masse en Tandem

En spectrométrie de masse en tandem, un ion précurseur d’un rapport masse/charge spécifique est sélectionné et fragmenté, et les masses des ions fragments sont mesurées. La dissociation induite par collision fragmente les peptides principalement au niveau des liaisons amides, produisant des ions b et y. La différence de masse entre les ions y ou b adjacents révèle la séquence d’acides aminés. Les méthodes de fragmentation à haute énergie comme la dissociation par transfert d’électron fournissent des informations complémentaires, préservant les modifications post-traductionnelles labiles.

Identification des Protéines

L’identification des protéines à partir des spectres de masse en tandem utilise des moteurs de recherche de bases de données tels que Mascot, Sequest ou MaxQuant. Les masses d’ions fragments observées sont comparées aux spectres théoriques générés par digestion in silico des séquences protéiques dans une base de données. L’analyse statistique détermine la confiance de chaque identification. Le séquençage de novo, qui dérive la séquence peptidique directement à partir du spectre de masse sans base de données, est utilisé pour les organismes dont le génome n’est pas séquencé ou pour identifier des peptides nouveaux.

Protéomique Quantitative

La protéomique quantitative mesure les changements d’abondance des protéines entre différentes conditions. Les méthodes basées sur des marqueurs introduisent des isotopes stables qui sont distingués par des décalages de masse. Le SILAC incorpore des acides aminés marqués isotopiquement par marquage métabolique en culture cellulaire. Le TMT et l’iTRAQ utilisent des marqueurs chimiques qui libèrent des ions rapporteurs lors de la fragmentation, permettant une quantification multiplexée jusqu’à 16 échantillons. La quantification sans marqueur compare les intensités des ions peptidiques ou les nombres de spectres entre les analyses, nécessitant une normalisation minutieuse.

Analyse des Modifications Post-Traductionnelles

La spectrométrie de masse est particulièrement adaptée à l’identification et à la localisation des modifications post-traductionnelles. La phosphorylation est détectée par une augmentation de masse caractéristique de 80 Da et une perte neutre d’acide phosphorique lors de la fragmentation. Des méthodes d’enrichissement comme la chromatographie d’affinité sur métal immobilisé ou la chromatographie sur dioxyde de titane sont utilisées pour purifier les phosphopeptides avant analyse. La glycosylation est plus difficile car les glycopeptides se fragmentent mal et les structures glycanniques sont hétérogènes. Des méthodes de fragmentation spécialisées comme la dissociation par transfert d’électron préservent les liaisons glycanne-peptide, permettant une analyse site-spécifique.

Protéomique Clinique

La protéomique clinique applique les technologies protéomiques aux problèmes médicaux. La découverte de biomarqueurs identifie les protéines dont l’abondance change dans les maladies, permettant potentiellement un diagnostic précoce ou un suivi thérapeutique à l’aide de techniques comme l’ELISA. La protéomique tissulaire analyse des échantillons cliniques fixés au formol et inclus en paraffine. La protéomique plasmatique est confrontée à des défis en raison de l’énorme gamme dynamique des concentrations protéiques, l’albumine représentant à elle seule plus de la moitié des protéines totales. La déplétion d’affinité des protéines abondantes et un fractionnement extensif sont généralement nécessaires pour une analyse approfondie du protéome plasmatique.