Le système double-hybride chez la levure détecte les interactions protéine-protéine dans des cellules de levure vivantes en reconstituant un facteur de transcription fonctionnel. C’est une méthode puissante et largement utilisée pour découvrir et caractériser les interactions binaires entre protéines.

Principe

Le système est basé sur la nature modulaire des facteurs de transcription, qui ont des domaines de liaison à l’ADN et d’activation séparables. La protéine d’intérêt, ou appât, est fusionnée au domaine de liaison à l’ADN d’un facteur de transcription tel que Gal4. Les protéines d’interaction potentielles, ou proies, sont fusionnées au domaine d’activation. L’interaction entre l’appât et la proie rapproche le domaine d’activation du domaine de liaison à l’ADN, reconstituant un facteur de transcription fonctionnel qui active l’expression des gènes rapporteurs.

Composants

L’appât est généralement cloné dans un vecteur qui exprime la protéine appât fusionnée au domaine de liaison à l’ADN de Gal4. La proie est exprimée à partir d’un vecteur de bibliothèque fusionné au domaine d’activation de Gal4. Les deux plasmides sont transformés dans une souche de levure rapporteuse contenant un ou plusieurs gènes rapporteurs sous le contrôle de séquences d’activation en amont répondant à Gal4.

Les gènes rapporteurs comprennent généralement HIS3, qui permet la croissance sur milieu dépourvu d’histidine, ADE2 pour la biosynthèse de l’adénine, et lacZ ou GFP pour la détection colorimétrique ou fluorescente. Plusieurs rapporteurs avec différents promoteurs réduisent les faux positifs. Des marqueurs contre-sélectionnables tels que URA3 et CYH2 peuvent éliminer les faux positifs par sélection négative dans certaines conditions.

Criblage de bibliothèque

Un criblage Y2H typique commence par la construction d’une bibliothèque d’ADNc dans le vecteur proie. L’appât est transformé dans la souche de levure rapporteuse, et la bibliothèque de proies est introduite par transformation à grande échelle. Les transformants sont étalés sur un milieu sélectif qui nécessite l’interaction pour la croissance. Les colonies apparaissant après 3 à 7 jours sont prélevées, et les plasmides proies sont récupérés et séquencés pour identifier la protéine d’interaction.

Le criblage nécessite une optimisation minutieuse. L’appât doit être testé pour l’autoactivation, où l’appât seul active la transcription du rapporteur. Si l’autoactivation se produit, l’appât peut être tronqué ou des vecteurs alternatifs peuvent être utilisés. Le niveau d’expression de l’appât et de la proie affecte la sensibilité. Les criblages à haut débit utilisant l’automatisation et des stratégies de regroupement permettent la cartographie des interactions à l’échelle du protéome.

Avantages et limites

Le Y2H détecte les interactions directes et binaires et peut identifier des interactions faibles ou transitoires qui pourraient être manquées par la co-immunoprécipitation et d’autres méthodes biochimiques d’extraction et purification des protéines. Le système est évolutif pour le haut débit, rentable et ne nécessite pas d’anticorps spécifiques aux protéines. Les interactions sont détectées dans un environnement cellulaire eucaryote.

Les limites comprennent les faux positifs provenant d’autoactivateurs, de protéines collantes et d’interactions fortuites. Les faux négatifs se produisent lorsque les protéines ne se replient pas correctement dans la levure, nécessitent des modifications post-traductionnelles absentes chez la levure, ou sont toxiques lorsqu’elles sont surexprimées. Les protéines membranaires sont problématiques car la localisation nucléaire du système est incompatible avec les environnements membranaires. Des variantes telles que le système split-ubiquitine répondent à certaines de ces limitations.

Variantes

Plusieurs variantes du Y2H étendent la technique de base. Le système double-hybride inverse détecte la disruption des interactions en criblant la perte d’expression du rapporteur, utile pour identifier les mutations ou les médicaments qui perturbent des interactions spécifiques. Le système simple-hybride détecte les interactions protéine-ADN en fusionnant le domaine de liaison à l’ADN à un facteur de transcription connu et en criblant pour l’activation. Le système triple-hybride détecte les interactions ARN-protéine en utilisant une molécule d’ARN hybride qui fait le pont entre l’appât et la proie.

Le double-hybride membranaire chez la levure utilise l’approche split-ubiquitine, où l’appât et la proie sont fusionnés à des moitiés d’ubiquitine. L’interaction reconstitue l’ubiquitine complète, qui est clivée par des protéases spécifiques de l’ubiquitine, libérant un facteur de transcription qui active les gènes rapporteurs. Cela permet la détection d’interactions impliquant des protéines membranaires dans leur environnement natif.

Applications

Le Y2H a été utilisé pour générer des cartes d’interaction à l’échelle du protéome pour des organismes incluant la levure, la drosophile, le ver et l’humain. Ces cartes révèlent des modules fonctionnels, identifient de nouveaux composants de voies et prédisent les fonctions de protéines non caractérisées. Les criblages Y2H ont identifié des interactions pertinentes pour les maladies, telles que les interactions entre protéines codées par des gènes liés à des troubles génétiques. La technologie a également été appliquée pour cartographier les interactions hôte-pathogène, révélant comment les protéines virales et bactériennes détournent la machinerie cellulaire hôte.