L’extraction et la purification des protéines sont des techniques essentielles pour isoler une protéine spécifique d’un mélange complexe de composants cellulaires. Les protéines purifiées sont nécessaires aux études structurelles, aux tests enzymatiques, à la production d’anticorps et aux applications thérapeutiques.
Comment fonctionnent l’extraction et la purification des protéines
- Lyse cellulaire
La première étape consiste à ouvrir les cellules pour libérer leur contenu. Cela se fait par des méthodes mécaniques telles que l’homogénéisation, la sonication ou le battage de billes, souvent en présence d’un tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéase pour empêcher la dégradation des protéines.
- Précisions
Le lysat est centrifugé pour agglomérer les débris insolubles, notamment les membranes cellulaires et les organites. Le surnageant, contenant les protéines solubles, est récupéré. Ce lysat clarifié constitue la matière première de la purification.
- Précipitation ou fractionnement
Une étape initiale d’enrichissement est parfois utilisée. La précipitation au sulfate d’ammonium précipite sélectivement les protéines en fonction de leur solubilité. La centrifugation différentielle peut séparer les protéines par taille dans un gradient de densité.
- Chromatographie
La méthode de purification la plus puissante est la chromatographie sur colonne, qui sépare les protéines en fonction de différentes propriétés :
- Chromatographie d’affinité : Un ligand ou un anticorps spécifique sur la colonne se lie à la protéine cible.
- Chromatographie échangeuse d’ions : Les protéines sont séparées par leur charge nette.
- Chromatographie d’exclusion de taille : Les protéines sont séparées par leur taille et leur forme.
- élution et collection
La protéine cible est libérée de la colonne en modifiant les conditions du tampon : modification de la concentration en sel, du pH ou ajout d’un ligand concurrent. La protéine purifiée est collectée en fractions et analysée pour en déterminer la pureté.
- Contrôle qualité
La protéine purifiée est analysée par SDS-PAGE ou électrophorèse capillaire sur gel (CGE) pour vérifier sa taille et sa pureté. Western blot confirme son identité. La concentration est mesurée à l’aide d’un test de quantification des protéines.
Protocole pratique d’extraction de protéines et de purification His-Tag
Récoltez les cellules (1 × 10⁷ cellules de mammifères ou 50 mL de culture bactérienne) par centrifugation à 500 × g pendant 5 minutes. Laver le culot avec du PBS glacé. Remettre en suspension dans 500 µL de tampon de lyse RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % désoxycholate de sodium, 0,1 % SDS) fraîchement complété avec 1 × cocktail d’inhibiteurs de protéase et 1 mM PMSF. Pour les cellules bactériennes exprimant une protéine marquée His, utilisez un tampon de lyse dénaturant (urée 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,0) ou un tampon natif (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazole 10 mM pH 8,0). Lyser les cellules par sonication sur glace : 3 impulsions de 15 secondes à 30 % d’amplitude avec des intervalles de refroidissement de 30 secondes. Centrifuger à 15 000 × g pendant 30 minutes à 4°C et récupérer le surnageant. Équilibrer 1 mL de résine d’agarose Ni-NTA dans une colonne gravitationnelle avec 10 volumes de colonne de tampon de liaison. Appliquer le lysat clarifié et recueillir le flux. Laver avec 10 volumes de colonne de tampon de lavage (tampon de liaison avec 20 à 50 mM d’imidazole). Éluer la protéine marquée His dans des fractions de 5 × 1 mL à l’aide d’un tampon d’élution (tampon de liaison avec 250 mM d’imidazole). Analyser 20 µL de chaque fraction (lysat, flux continu, lavage, élutions) par SDS-PAGE à 12 %. Colorer avec du bleu de Coomassie pour visualiser la protéine cible : une seule bande au poids moléculaire attendu dans les fractions d’élution indique une purification réussie. Pour une pureté plus élevée, regrouper les fractions d’élution et exécuter sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (Superdex 200) équilibrée avec un tampon de stockage (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 10 % de glycérol).
Application du monde réel
Une kinase humaine marquée 6 × His (MAPK14/p38α, 41 kDa) est exprimée dans E. coli BL21 (DE3) avec une induction d’IPTG 0,5 mM pendant 4 heures à 30°C. Après purification du Ni-NTA, SDS-PAGE montre une bande importante de 41 kDa dans les fractions d’élution avec une pureté > 90 %. La protéine est concentrée à 5 mg/mL, surgelée dans de l’azote liquide et conserve > 80 % de l’activité kinase dans un test de phosphorylation.
