Tulang, gigi, dan jaringan terkalsifikasi tidak dapat dipotong pada mikrotom tanpa menghilangkan garam kalsium terlebih dahulu. Dekalsifikasi (dekal) melunakkan jaringan dengan mengekstraksi ion kalsium, meninggalkan matriks organik utuh untuk pemrosesan dan pemotongan. Pilihan metode dekalsifikasi tergantung pada seberapa mendesak hasil diperlukan dan tes hilir mana yang direncanakan.
Mengapa Mendekalsifikasi?
Kristal kalsium hidroksiapatit (Ca10(PO4)6(OH)2) dalam tulang dan kalsifikasi patologis membuat jaringan terlalu keras untuk pemotongan mikrotom. Bahkan spesimen tulang tipis (misalnya, biopsi trefin sumsum tulang yang didekalsifikasi) akan menghancurkan pisau mikrotom atau menghasilkan irisan yang tidak dapat digunakan jika tidak didekalsifikasi. Dekalsifikasi diperlukan untuk semua jaringan termineralisasi termasuk tulang, gigi, katup jantung terkalsifikasi, arteri aterosklerotik, dan kalsifikasi tumoral.
Dekalsifikasi Asam
Asam kuat (asam nitrat 5-10%, asam format 10-20%) mendekalsifikasi dengan cepat — fragmen tulang kecil dalam 2-6 jam, tulang kortikal dalam 24-48 jam. Asam nitrat adalah yang tercepat tetapi dapat menghidrolisis asam nukleat dan mendegradasi protein, mengompromikan IHC dan pengujian molekuler. Asam format lebih lembut dan lebih disukai ketika IHC atau PCR direncanakan.
Mekanisme dekalsifikasi asam — proton (H+) menggantikan ion kalsium dari hidroksiapatit, membentuk garam kalsium larut yang berdifusi keluar dari jaringan. Laju reaksi tergantung pada konsentrasi asam, suhu (meningkatkan suhu mempercepat tetapi meningkatkan kerusakan jaringan), dan agitasi. Titik akhir ditentukan oleh pengujian kimia cairan dekalsifikasi untuk kalsium (oksalat atau strip tes kalsium) atau dengan penilaian fisik (jaringan menekuk tanpa resistensi).
Agen pengkhelat (EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid, 10-14%, pH 7,0-7,4) mendekalsifikasi dengan mengikat ion kalsium dalam kompleks khelat yang stabil. EDTA jauh lebih lambat daripada asam — dekalsifikasi memakan waktu 2-14 hari tergantung ukuran dan densitas jaringan — tetapi mempertahankan morfologi, antigenisitas, dan asam nukleat lebih baik daripada metode asam apa pun. EDTA adalah metode dekalsifikasi yang lebih disukai ketika IHC, FISH, atau PCR akan dilakukan. Dekalsifikasi EDTA pada 4°C bahkan lebih lambat (3-4 minggu) tetapi memberikan preservasi asam nukleat optimal.
Protokol Dekalsifikasi
Biopsi trefin sumsum tulang — difiksasi dalam formalin selama 2-4 jam, didekalsifikasi dalam EDTA atau asam format selama 2-4 jam (inti kecil) hingga 24 jam (inti besar). Dekalsifikasi berlebihan menghancurkan detail seluler sumsum dan mengompromikan IHC untuk penanda limfoid dan sel plasma.
Kepala femur dan spesimen tulang besar — difiksasi dalam formalin selama 24-48 jam, dipotong pada gergaji pita menjadi irisan setebal 3-5 mm, didekalsifikasi dalam larutan asam format-natrium sitrat atau EDTA selama 2-7 hari. Ganti larutan dekalsifikasi setiap hari. Uji titik akhir dengan amonium oksalat — pembentukan endapan mengindikasikan kalsium masih dilepaskan.
Tumor jaringan lunak terkalsifikasi — dekalsifikasi dalam EDTA untuk mempertahankan antigenisitas IHC. Dekalsifikasi asam dapat menutupi penanda yang penting untuk klasifikasi tumor.
Deteksi Titik Akhir
Pengujian kimia — tambahkan 1 mL cairan dekalsifikasi ke 5 mL larutan amonium oksalat; endapan putih (kalsium oksalat) dalam 30 detik mengindikasikan dekalsifikasi tidak lengkap. X-ray — spesimen dapat diradiografi untuk mendeteksi kalsifikasi sisa. Fisik — pin pengaman atau pisau skalpel yang ditekuk harus melewati jaringan tanpa resistensi; jaringan harus terasa seperti keju keras, bukan tulang.
Artefak dan Masalah
Dekalsifikasi berlebihan — masalah paling umum. Paparan asam berlebihan menghancurkan basofilia inti (H&E menunjukkan inti pucat seperti hantu), memfragmentasi DNA (kegagalan PCR), dan mendenaturasi protein (IHC negatif palsu). Dekalsifikasi EDTA berlebihan kurang merusak tetapi tetap harus dihindari. Dekalsifikasi kurang — irisan mengandung area keras dan berpasir yang merobek irisan atau merusak pisau; proses ulang blok dalam larutan dekalsifikasi untuk waktu tambahan. Pigmen hematin asam — kristal birefringen coklat-hitam dari interaksi asam dengan hemoglobin tetap formalin; dihilangkan dengan pengobatan dengan asam pikrik alkohol jenuh.
Kontrol Mutu
Dokumentasikan metode dekalsifikasi, waktu, suhu, dan titik akhir. Nilai preservasi inti pada H&E — jaringan yang didekalsifikasi dengan baik menunjukkan detail inti tajam yang sebanding dengan jaringan non-dekalsifikasi. Kontrol IHC harus menyertakan jaringan didekalsifikasi untuk memverifikasi preservasi antigen. Kontrol positif untuk IHC harus didekalsifikasi dengan metode yang sama dengan jaringan uji. Partisipasi dalam program EQA untuk patologi sumsum tulang dan tulang mencakup penilaian kualitas dekalsifikasi.
