Sekuensing Sanger, juga dikenal sebagai sekuensing terminasi rantai, adalah metode yang digunakan untuk menentukan urutan tepat nukleotida dalam molekul DNA. Dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1977, metode ini tetap menjadi standar emas untuk memvalidasi sekuens DNA dan mendeteksi mutasi.
Cara Kerja Sekuensing Sanger
- Menyiapkan Reaksi
DNA yang akan disekuensing dicampur dengan primer DNA, DNA polimerase, nukleotida normal (dNTP), dan sejumlah kecil dideoksinukleotida berlabel fluoresen (ddNTP). Masing-masing dari empat ddNTP diberi label dengan pewarna fluoresen yang berbeda.
- Terminasi Rantai
Reaksi dimulai dengan pengikatan primer ke DNA templat. DNA polimerase memperpanjang primer dengan menambahkan dNTP. Setiap kali ddNTP dimasukkan sebagai pengganti dNTP, rantai berhenti tumbuh karena ddNTP tidak memiliki gugus 3’-hidroksil yang diperlukan untuk perpanjangan lebih lanjut.
- Generasi Fragmen
Proses ini menghasilkan campuran fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi, masing-masing berakhir pada posisi nukleotida tertentu. Label fluoresen pada ddNTP penghenti mengidentifikasi basa mana yang berada di ujung setiap fragmen.
- Elektroforesis Kapiler
Campuran dimuat ke dalam instrumen elektroforesis kapiler. Fragmen dipisahkan berdasarkan ukuran saat mereka bermigrasi melalui kapiler. Laser membangkitkan label fluoresen, dan detektor merekam warna mana yang lewat pada setiap titik waktu.
- Analisis Kromatogram
Instrumen menghasilkan kromatogram — serangkaian puncak berwarna yang mewakili urutan nukleotida. Sekuens dibaca dari kromatogram, biasanya dari fragmen terpendek hingga terpanjang, memberikan sekuens DNA lengkap.
