Spektroskopi fluoresensi adalah teknik analitis yang mengukur emisi cahaya dari molekul setelah eksitasi oleh foton. Teknik ini sangat sensitif (batas deteksi hingga pM), selektif, dan banyak digunakan dalam biokimia, analisis lingkungan, dan ilmu material.
Prinsip Fluoresensi
Sebuah molekul menyerap foton dan dipromosikan dari keadaan dasar (S0) ke keadaan singlet tereksitasi (S1 atau S2). Konversi internal dengan cepat merelaksasi molekul ke tingkat vibrasi terendah S1 (Aturan Kasha). Fluoresensi terjadi ketika molekul kembali ke S0 dengan memancarkan foton, dan cahaya yang dipancarkan memiliki panjang gelombang lebih panjang (energi lebih rendah) daripada cahaya yang diserap, fenomena yang dikenal sebagai pergeseran Stokes. Pergeseran ini timbul dari kehilangan energi melalui relaksasi vibrasi dan reorganisasi pelarut, dan pergeseran Stokes yang besar (20-100 nm) memungkinkan pemisahan cahaya eksitasi dan emisi oleh filter atau monokromator. Diagram Jablonski mengilustrasikan proses fotofisika ini: absorpsi, konversi internal, fluoresensi, persilangan antar sistem, dan fosforesensi.
Parameter Fluoresensi
Parameter fluoresensi kunci meliputi hasil kuantum, masa hidup, dan intensitas. Hasil kuantum (Φ) adalah rasio foton yang dipancarkan terhadap foton yang diserap (Φ = kemitted/kabsorbed), dengan nilai mulai dari kurang dari 0,01 (fluoresensi lemah) hingga mendekati 1,0 (sangat fluorescent, mis., fluoresein pada pH 9, Φ = 0,95). Masa hidup (τ) adalah waktu rata-rata molekul berada dalam keadaan tereksitasi sebelum memancarkan foton, biasanya 1-10 ns untuk fluorofor organik. Intensitas fluoresensi mengikuti I = I0 × (1 - 10-εbc) × Φ, di mana ε adalah absorptivitas molar, b adalah panjang jalur, dan c adalah konsentrasi; pada konsentrasi rendah, intensitas sebanding dengan konsentrasi.
Fluorofor
Fluorofor dikategorikan sebagai intrinsik atau ekstrinsik. Fluorofor intrinsik adalah molekul fluorescent yang terjadi secara alami seperti asam amino aromatik (triptofan, λex ~280 nm, λem ~350 nm), NADH, flavin, dan klorofil. Fluorofor ekstrinsik adalah pewarna sintetis yang ditambahkan ke sampel non-fluoresen, termasuk fluoresein (λex 494 nm, λem 518 nm), rodamin, pewarna sianin (Cy3, Cy5), dan seri Alexa Fluor. Titik kuantum adalah nanokristal semikonduktor dengan emisi yang dapat disetel ukuran, eksitasi lebar, emisi sempit, dan fotostabilitas tinggi.
Instrumentasi
Spektrometer fluoresensi mencakup sumber cahaya seperti lampu busur xenon (spektrum lebar, 200-1000 nm) atau LED untuk pengukuran keadaan tunak, dan laser berdenyut atau LED untuk pengukuran resolus-waktu. Monokromator eksitasi memilih panjang gelombang eksitasi, dan monokromator ganda mengurangi cahaya sesat untuk pengukuran sensitivitas tinggi. Kompartemen sampel menggunakan kuvet kuarsa bening empat sisi untuk geometri deteksi sudut kanan, atau geometri muka-depan untuk sampel yang sangat menyerap atau menghamburkan. Monokromator emisi memindai panjang gelombang emisi sementara filter lolos panjang memblokir cahaya eksitasi yang terhambur, dan detektor biasanya tabung fotomultiplier (PMT) untuk sensitivitas tinggi atau CCD untuk deteksi multisaluran.
Teknik Fluoresensi
Beberapa teknik fluoresensi khusus ada. Fluoresensi keadaan tunak mengukur intensitas emisi pada panjang gelombang eksitasi tetap dan digunakan untuk penentuan konsentrasi dan karakterisasi spektrum emisi. Fluoresensi resolus-waktu mengukur peluruhan fluoresensi setelah pulsa eksitasi pendek dan digunakan untuk menentukan masa hidup fluoresensi, membedakan pemadaman dinamis dari statis, dan mempelajari dinamika molekul. Transfer Energi Resonansi Fluoresensi (FRET) melibatkan transfer energi non-radiatif dari fluorofor donor ke akseptor dalam jarak 1-10 nm, dengan efisiensi sebanding dengan 1/r6, menjadikannya penggaris molekul untuk jarak dalam protein dan asam nukleat. Polarisasi fluoresensi (anisotropi) mengukur mobilitas rotasi fluorofor dan digunakan dalam studi pengikatan dan immunoassay.
Pemadaman
Pemadaman fluoresensi dapat terjadi melalui dua mekanisme. Pemadaman dinamis (tumbukan) terjadi ketika pemadam seperti O2, I-, atau akrilamida berdifusi dan bertumbukan dengan fluorofor selama keadaan tereksitasi, dijelaskan oleh persamaan Stern-Volmer: F0/F = 1 + KSV[Q]. Pemadaman statis terjadi ketika pemadam membentuk kompleks keadaan dasar non-fluoresen dengan fluorofor. Kedua mekanisme dibedakan dengan pengukuran masa hidup: pemadaman dinamis mengurangi masa hidup sedangkan pemadaman statis tidak.
Aplikasi
Spektroskopi fluoresensi digunakan untuk analisis kuantitatif analit fluorescent dalam sampel farmasi dan lingkungan, uji aktivitas enzim menggunakan substrat fluorogenik, sekuensing DNA dan analisis mikroarray menggunakan label fluorescent, pencitraan sel dan sitometri aliran menggunakan antibodi dan pewarna fluorescent, dan pemantauan lingkungan polutan seperti hidrokarbon aromatik polisiklik dan zat humat.
