Ikhtisar
Perakitan genom adalah proses komputasi untuk merekonstruksi seluruh rangkaian genom dari fragmen DNA pendek yang dihasilkan oleh platform pengurutan throughput tinggi. Karena mesin pengurutan hanya membaca ratusan pasangan basa dalam satu waktu, ahli bioinformatika harus mengumpulkan jutaan atau miliaran pembacaan ini, seperti memecahkan teka-teki gambar yang sangat besar. Keakuratan genom yang dirakit secara langsung memengaruhi setiap analisis hilir, mulai dari prediksi gen hingga genomik komparatif. Perakit modern menangani kompleksitas wilayah yang berulang, kesalahan pengurutan, dan kedalaman cakupan yang bervariasi menggunakan algoritme berbasis grafik yang canggih.
Konsep Utama
Ada dua strategi utama untuk perakitan genom. Perakitan de novo membuat genom tanpa referensi sebelumnya, mengandalkan pendekatan konsensus tata letak tumpang tindih (OLC) atau grafik de Bruijn untuk menggabungkan bacaan ke dalam rangkaian berdekatan yang disebut contigs. Perakitan dengan panduan referensi membaca peta ke genom referensi yang diketahui dan kemudian merakit bagian yang belum dipetakan, yang sangat berguna untuk proyek pengurutan ulang. Metrik kualitas utama mencakup N50 (panjang konfigurasi yang memuat 50% rakitan) dan total ukuran rakitan. Validasi perakitan sering kali melibatkan pemeriksaan terhadap urutan yang diketahui atau menggunakan teknologi yang sudah lama dibaca untuk menutup celah.
Aplikasi
Perakitan genom merupakan dasar bagi hampir setiap aplikasi genomik. Hal ini memungkinkan penemuan gen baru, identifikasi varian struktural, dan karakterisasi elemen regulasi non-coding. Dalam bidang kedokteran, genom yang dikumpulkan dari patogen memungkinkan pelacakan wabah dengan cepat dan profil resistensi antibiotik. Genomik pertanian bergantung pada perakitan berkualitas tinggi untuk memetakan sifat-sifat yang penting secara ekonomi. Proyek modern sering kali menggabungkan data pengurutan generasi berikutnya dengan pembacaan panjang dan pemetaan optik untuk menghasilkan kumpulan tingkat kromosom, berdasarkan metode pengurutan DNA klasik. Perakitan juga mendasari studi fungsional seperti desain target CRISPR-Cas9, yang mana prediksi di luar target bergantung pada referensi yang akurat.
Protokol Praktis
Untuk perakitan genom bakteri de novo berbasis Illumina, mulailah dengan pemangkasan kualitas: fastp -i R1.fastq -I R2.fastq -o trimmed_R1.fastq -O trimmed_R2.fastq -q 20 -l 50. Rakit dengan SPAdes menggunakan beberapa ukuran k-mer: spades.py -1 trimmed_R1.fastq -2 trimmed_R2.fastq -o spades_output -k 21,33,55,77 --careful. Tanda --hati-hati mengurangi ketidakcocokan dan indel dengan menjalankan MismatchCorrector. Outputnya mencakup contigs.fasta dan scaffolds.fasta. Untuk perakitan yang sudah lama dibaca dengan data Oxford Nanopore, gunakan Flye: flye --nano-raw reads.fastq -o flye_out -t 8 -g 5m, dengan -g memberikan perkiraan ukuran genom. Untuk perakitan hibrid yang menggabungkan pembacaan pendek dan panjang, gunakan Unicycler: unicycler -1 short_R1.fastq -2 short_R2.fastq -l long_reads.fastq -o hybrid_assembly. Menilai kualitas perakitan dengan QUAST: quast.py contigs.fasta -r reference.fasta -g gen.gff -o quast_output. Metrik utama mencakup N50 (panjang konfigurasi yang mencakup 50% perakitan), ukuran total perakitan, jumlah konfigurasi, fraksi genom (fraksi referensi yang tercakup), dan jumlah misassemblies. Untuk genom bakteri yang lengkap, usahakan N50 sama dengan panjang kromosom dan kandungan GC yang sesuai dengan referensi. Periksa kelengkapan dengan BUSCO terhadap silsilah yang sesuai: busco -i contigs.fasta -lbacteria_odb10 -o busco_out -m genome. Rakitan Polandia dengan Pilon untuk memperbaiki kesalahan menggunakan penyelarasan baca: pilon --genome contigs.fasta --frags aligned.bam --output dipoles. Untuk perancah tingkat kromosom, gunakan data Hi-C dengan SALSA2 atau 3D-DNA untuk mengurutkan dan mengarahkan contig ke dalam pseudomolekul skala kromosom.
