Ikhtisar
Analisis data spektrometri massa adalah jalur komputasi yang mengubah file spektral mentah dari spektrometer massa menjadi daftar peptida dan protein yang teridentifikasi dan terukur. Data mentah menjalani langkah-langkah pra-pemrosesan, pemfilteran kebisingan, pemusatan massa, penetapan status pengisian daya, dan pengambilan puncak, sebelum upaya identifikasi peptida. Kualitas dan kedalaman daftar protein akhir sangat bergantung pada metode perolehan dan strategi komputasi yang digunakan. Eksperimen proteomik modern secara rutin menghasilkan jutaan spektrum, menjadikan jalur analisis otomatis yang kuat menjadi penting untuk mengekstraksi makna biologis dari data.
Metode
Penelusuran database mencocokkan spektrum massa tandem eksperimental dengan spektrum teoretis yang dihasilkan secara silico dari database urutan protein. Mesin pencari seperti SEQUEST, Andromeda, dan Comet menggunakan korelasi silang atau penilaian berbasis probabilitas untuk menentukan peringkat kecocokan spektrum peptida. Pengurutan de novo merekonstruksi rangkaian peptida langsung dari spektrum tanpa database, yang berguna bagi organisme dengan genom yang tidak diurutkan atau untuk mengidentifikasi peptida baru. Pendekatan hibrid seperti pencarian perpustakaan spektral cocok dengan spektrum yang telah diidentifikasi dan divalidasi sebelumnya, sehingga menawarkan sensitivitas yang lebih tinggi untuk peptida yang diketahui. Semua metode memerlukan estimasi tingkat penemuan palsu yang ketat, biasanya menggunakan strategi umpan target.
Protokol Praktis
Jalur analisis data praktis untuk kuantifikasi bebas label dimulai dengan file spektral mentah dari akuisisi DDA. Langkah prapemrosesan pertama mengonversi file mentah khusus vendor ke format terbuka seperti mzML menggunakan alat msConvert ProteoWizard. Pengambilan puncak mendeteksi puncak terpusat dari data mode profil dengan mengidentifikasi maksimum lokal dan menyesuaikan selubung isotop. Pemfilteran kebisingan menghilangkan puncak di bawah ambang batas signal-to-noise sebesar 2. Status muatan ditetapkan dengan mendekonvolusi pola isotop menggunakan algoritma seperti Decon2LS. Penyelarasan waktu retensi sangat penting untuk kuantifikasi lintas proses: algoritme MaxLFQ menyelaraskan kromatogram dengan mengidentifikasi fitur peptida umum di seluruh proses dan menerapkan pergeseran waktu retensi non-linier. Setelah penyelarasan, korespondensi fitur dibuat, peptida yang sama dilacak di semua proses dengan mencocokkan m/z, muatan, dan waktu retensi yang diselaraskan dalam rentang 10 ppm dan 1 menit. Nilai yang hilang, yang umum terjadi pada eksperimen bebas label, diperhitungkan menggunakan imputasi k-tetangga terdekat atau imputasi sensor kiri dengan asumsi nilai yang hilang mewakili peptida di bawah batas deteksi. Matriks akhir intensitas peptida di seluruh sampel dinormalisasi menggunakan normalisasi penstabil varians dan dilakukan pengujian statistik seperti uji limma atau uji-t dengan beberapa koreksi pengujian. Contoh dunia nyata: saluran pipa ini diterapkan untuk menganalisis proteom dari 200 sampel cairan serebrospinal dari pasien penyakit Alzheimer, mengidentifikasi 50 protein yang secara konsisten mengalami disregulasi termasuk fragmen tau dan peptida amiloid-beta. Pendekatan yang sama digunakan dalam proteomik plasma untuk menemukan kandidat biomarker untuk deteksi dini kanker ovarium pada kelompok pasien yang besar.
Aplikasi
Analisis data spektrometri massa merupakan hal mendasar dalam setiap eksperimen proteomik. Ini mendukung identifikasi protein yang dipisahkan oleh SDS-PAGE, capillary zone electrophoresis, atau HPLC, dan merupakan mesin komputasi di balik alur kerja proteomik dan spektrometri massa modern. Proteomik klinis mengandalkan jalur analitik ini untuk menemukan kandidat biomarker, sementara kemajuan instrumentasi spektrometri massa terus mendorong pengembangan algoritme baru untuk interpretasi data yang lebih cepat dan akurat.
