Ikhtisar
Analisis data microarray mengubah intensitas fluoresensi mentah dari microarray hibridisasi menjadi pengukuran ekspresi gen yang bermakna. Meskipun RNA-seq sebagian besar telah menggantikan microarray untuk studi berbasis penemuan, microarray tetap banyak digunakan dalam diagnostik klinis, pemuliaan tanaman, dan studi populasi besar karena biayanya yang rendah, protokol yang terstandarisasi, dan jalur analisis yang sudah mapan. Sebuah microarray tunggal dapat mengukur ekspresi puluhan ribu transkrip secara bersamaan dengan memanfaatkan pasangan basa komplementer antara sampel cDNA dan probe yang tidak bergerak. Alur kerja analisis membahas karakteristik teknis unik dari data microarray, termasuk koreksi latar belakang, normalisasi, dan ringkasan tingkat penyelidikan.
Metode
Analisis microarray dimulai dengan pemrosesan gambar untuk mengekstraksi intensitas tingkat probe. Koreksi latar belakang menghilangkan sinyal nonspesifik menggunakan metode seperti rata-rata multi-array (RMA) yang kuat atau penyesuaian konten GC. Normalisasi membuat array dapat dibandingkan: normalisasi kuantil adalah pendekatan paling umum untuk array satu warna, sedangkan normalisasi loess diterapkan pada desain dua warna. Peringkasan pemeriksaan (untuk array Affymetrix, menggunakan RMA atau PLIER) menggabungkan beberapa pemeriksaan per gen menjadi satu nilai ekspresi. Penilaian kualitas menggunakan gambar semu, plot NUSE, dan plot RLE untuk mengidentifikasi array yang bermasalah. Ekspresi diferensial diuji dengan limma, yang menggunakan moderasi empiris Bayes untuk menstabilkan estimasi varians antar gen. Efek batch dideteksi dengan analisis komponen utama dan diperbaiki menggunakan ComBat atau deleteBatchEffect limma.
Aplikasi
Meskipun sequencing meningkat, microarray terus memberikan nilai. Tes MammaPrint dan Oncotype DX yang disetujui FDA menggunakan microarray untuk prognosis kanker payudara. Panel klinis microarray DNA dan ekspresi gen memandu keputusan pengobatan dalam diagnosis onkologi dan penyakit langka. Analisis data microarray juga mendukung validasi hasil qPCR melalui studi korelasi qPCR dan melengkapi pengurutan DNA dengan membuat profil ekspresi dalam skala besar. Dalam genomik pertanian, microarray memungkinkan pemetaan sifat yang hemat biaya dan seleksi berbantuan penanda pada populasi pembiakan dalam jumlah besar.
Protokol Praktis
Untuk analisis microarray Affymetrix di R/Bioconductor, mulailah dengan membaca file CEL dengan paket oligo atau affy. Buat ExpressionFeatureSet: data <- read.celfiles(list.celfiles()). Lakukan normalisasi RMA dalam satu langkah dengan eset <- rma(data), yang menerapkan koreksi latar belakang (konvolusi distribusi sinyal dan noise), normalisasi kuantil di seluruh array, dan ringkasan tingkat probe melalui pemolesan median. Matriks ekspresi yang dihasilkan berisi nilai transformasi log2 yang siap dianalisis. Menilai kualitas array dengan plot NUSE (Normalized Unscaled Standard Error) dan RLE (Relative Log Expression); array dengan median NUSE di atas 1,05 atau rentang interkuartil RLE yang menyimpang dari norma harus ditandai. Pengujian ekspresi diferensial menggunakan limma: pertama-tama sesuaikan model linier dengan fit <- lmFit(eset, design) dengan design adalah matriks model yang dibuat dengan model.matrix(~ condition). Kemudian terapkan moderasi Bayes empiris dengan fit2 <- eBayes(fit) dan ekstrak hasilnya dengan topTable(fit2, coef = 2, number = Inf, adjust = "BH"). Outputnya mencakup perubahan lipatan log, ekspresi rata-rata, statistik t yang dimoderasi, nilai p, dan nilai p yang disesuaikan Benjamini-Hochberg. Untuk array dua warna, gunakan limma dengan normalizeWithinArrays (normalisasi loess) dan normalizeBetweenArrays (normalisasi skala). Efek batch yang diidentifikasi dalam plot PCA dapat diperbaiki dengan ComBat(dat, batch) dari paket sva. Visualisasikan hasil dengan plot gunung berapi, peta panas dari probe yang diekspresikan secara berbeda, dan plot MA untuk memeriksa bias yang bergantung pada intensitas. Beri anotasi pada probe pada gen menggunakan paket anotasi khusus platform (misalnya, hgu133plus2.db untuk array Human Genome U133 Plus 2.0).
