PCR kuantitatif (qPCR), juga dikenal sebagai PCR real-time, adalah teknik laboratorium yang mengamplifikasi dan secara simultan mengkuantifikasi DNA secara real-time. Tidak seperti PCR konvensional, yang hanya menunjukkan jumlah akhir DNA, qPCR memantau akumulasi DNA sepanjang reaksi menggunakan fluoresensi.
Cara Kerja qPCR
- Persiapan Reaksi
Reaksi mengandung komponen yang sama dengan PCR konvensional — DNA templat, primer, DNA polimerase, dan nukleotida — plus reporter fluoresen. Dua sistem reporter umum adalah SYBR Green, pewarna yang berpendar ketika terikat pada DNA untai ganda, dan probe TaqMan, yang merupakan probe fluoresen spesifik sekuens.
- Amplifikasi dan Deteksi
Reaksi mengalami siklus termal yang sama dengan PCR standar: denaturasi, annealing, dan ekstensi. Setelah setiap siklus, pengukuran fluoresensi diambil. Semakin banyak DNA yang diamplifikasi, sinyal fluoresensi meningkat secara proporsional.
- Nilai Ct
Siklus ambang (Ct) adalah nomor siklus di mana sinyal fluoresensi naik di atas tingkat latar belakang. Nilai Ct berbanding terbalik dengan jumlah awal DNA target: semakin banyak DNA awal berarti semakin sedikit siklus yang diperlukan untuk mencapai ambang.
- Kuantifikasi
Kuantifikasi absolut menggunakan kurva standar dari konsentrasi DNA yang diketahui untuk menghitung jumlah pasti DNA target. Kuantifikasi relatif membandingkan nilai Ct dari gen target ke gen referensi, menentukan perubahan lipatan dalam ekspresi.
- Analisis Kurva Leleh
Ketika SYBR Green digunakan, analisis kurva leleh dilakukan setelah amplifikasi. DNA dipanaskan secara perlahan sementara fluoresensi dipantau. Setiap produk DNA meleleh pada suhu karakteristik, mengonfirmasi bahwa amplicon yang benar diproduksi dan tidak ada primer-dimer.
