Ikhtisar
Jaringan interaksi protein-protein (PPI) adalah representasi grafik dari kontak fisik antara protein dalam sel. Setiap protein adalah sebuah node, dan setiap interaksi yang terdeteksi secara eksperimental atau diprediksi secara komputasi adalah sebuah keunggulan. Jaringan ini mengungkap organisasi fungsional proteom, protein yang berinteraksi sering kali berpartisipasi dalam proses biologis yang sama, berada di kompartemen seluler yang sama, atau membentuk kompleks yang stabil. Dengan mempelajari topologi jaringan, peneliti dapat mengidentifikasi protein hub yang sangat terhubung, modul fungsional, dan jalur yang tidak diatur dalam penyakit. Jaringan PPI mengintegrasikan data dari berbagai teknik eksperimental dan penting untuk biologi sistem.
Konsep Utama
Sumber eksperimental untuk data PPI mencakup skrining dua-hibrida ragi, pemurnian afinitas diikuti dengan spektrometri massa (AP-MS), dan ko-imunopresipitasi. Setiap metode menangkap aspek interaksi yang berbeda, biner versus kokompleks, stabil versus sementara. Properti jaringan seperti distribusi derajat, koefisien pengelompokan, dan sentralitas antar-kesatuan menjadi ciri arsitektur global. Protein hub yang menghubungkan banyak pasangan seringkali penting untuk kelangsungan hidup sel. Modul fungsional adalah subgraf yang terhubung erat dan sesuai dengan kompleks protein atau jalur sinyal. Penyakit sering kali timbul dari mutasi yang mengganggu tepi atau simpul tertentu dalam jaringan ini, sebuah konsep yang dikenal sebagai pengobatan jaringan.
Protokol Praktis
Alur kerja praktis AP-MS dimulai dengan ekspresi protein umpan yang diberi tag pada garis sel yang relevan. Umpan biasanya digabungkan dengan tag FLAG, GFP, atau StrepII menggunakan transfeksi stabil atau transduksi lentiviral. Sel yang mengekspresikan umpan yang diberi tag dilisiskan dalam kondisi lembut - biasanya 0,5% NP-40 atau buffer digitonin - untuk mengawetkan kompleks protein. Lisat diinkubasi dengan resin afinitas, seperti manik agarosa anti-FLAG atau StrepTactin Sepharose, selama 2-4 jam pada suhu 4C. Setelah pencucian ekstensif dengan buffer lisis untuk menghilangkan pengikat nonspesifik, protein terikat dielusi menggunakan peptida FLAG berlebih atau buffer elusi SDS. Eluat dicerna dengan trypsin dan dianalisis dengan LC-MS/MS. Data mentah dicari berdasarkan database protein, dan daftar protein yang dihasilkan disaring untuk menghilangkan kontaminan umum menggunakan repositori CRAPome. Penyaringan statistik membandingkan kelimpahan mangsa dalam sampel umpan dengan kontrol menggunakan skor SAINT, yang mengintegrasikan jumlah spektral dan reproduktifitas di seluruh replika biologis. Interaksi berkeyakinan tinggi dengan probabilitas SAINT di atas 0,95 digunakan untuk membangun jaringan PPI di Cytoscape. Untuk eksperimen BioID, alur kerjanya serupa tetapi menggunakan ligase biotin promiscuous yang menyatu dengan umpan, yang melakukan biotinilasi protein proksimal dalam sel hidup; protein yang terbiotinilasi ditangkap pada butiran streptavidin, memungkinkan deteksi interaksi sementara dan lemah. Dalam aplikasi contoh, AP-MS dari proteasome 26S manusia mengidentifikasi 33 subunit dan 10 pendamping perakitan, mengungkapkan jalur biogenesis kompleks penting ini. BioID telah digunakan untuk memetakan interaksi selubung inti, mengidentifikasi lebih dari 300 protein dan menemukan komponen baru dari kompleks pori inti.
Aplikasi
Jaringan PPI digunakan untuk memprediksi fungsi protein berdasarkan rasa bersalah - protein yang tidak memiliki karakter yang berinteraksi dengan protein perbaikan DNA yang diketahui kemungkinan besar terlibat dalam perbaikan DNA. Dalam penemuan obat, jaringan mengidentifikasi modul penyakit dan memprioritaskan target terapeutik. Bidang ini dibangun berdasarkan metode eksperimental seperti sistem dua-hibrida ragi dan interaksi antigen-antibodi untuk validasi. Analisis jaringan juga mengkontekstualisasikan data dari interaksi protein-protein untuk menghasilkan hipotesis mekanistik tentang regulasi seluler.
