Interaksi protein-protein adalah kontak fisik antar protein yang mendasari semua proses seluler. Protein jarang bertindak sendiri tetapi berfungsi sebagai komponen jaringan interaksi yang kompleks, membentuk kompleks sementara atau stabil yang menjalankan fungsi biologis.
Jenis Interaksi
Interaksi protein-protein berkisar dari kompleks stabil permanen seperti ribosom atau proteasom, hingga interaksi sementara yang terbentuk dan terdisosiasi sebagai respons terhadap peristiwa pensinyalan. Interaksi dapat bersifat obligat, di mana subunit tidak stabil jika terisolasi, atau non-obligat, di mana protein individu stabil dengan sendirinya. Antarmuka kompleks stabil cenderung lebih besar dan lebih hidrofobik daripada interaksi sementara, yang sering melibatkan residu polar dan bermuatan.
Permukaan Interaksi
Antarmuka protein-protein biasanya mengubur 600 hingga 2000 angstrom persegi luas permukaan yang dapat diakses pelarut. Antarmuka diperkaya dalam residu hidrofobik, yang terkubur saat pembentukan kompleks, dan sering mengandung tambalan hidrofobik pusat yang dikelilingi oleh interaksi polar. Titik panas adalah residu yang berkontribusi secara tidak proporsional terhadap energi pengikatan, biasanya triptofan, arginin, dan tirosin. Residu titik panas ini dikelilingi oleh residu yang kurang penting secara energetik yang mengecualikan air dari antarmuka.
Afinitas Pengikatan dan Kinetika
Kekuatan interaksi protein-protein digambarkan oleh konstanta disosiasi, yang dapat berkisar dari pikomolar untuk interaksi afinitas tinggi hingga mikromolar untuk interaksi lemah sementara. Kd ditentukan oleh laju asosiasi dan disosiasi. Laju asosiasi dipengaruhi oleh pengarahan elektrostatik, di mana muatan komplementer pada kedua protein mempercepat pertemuan mereka. Laju disosiasi menentukan masa pakai interaksi, dengan disosiasi lambat menghasilkan kompleks berumur panjang dan disosiasi cepat memungkinkan penghentian sinyal yang cepat.
Ko-Imunopresipitasi
Ko-imunopresipitasi adalah metode yang banyak digunakan untuk mendeteksi interaksi protein-protein. Antibodi terhadap protein umpan digunakan untuk menangkapnya bersama dengan mitra interaksinya dari lisat sel. Protein yang diendapkan dipisahkan oleh SDS-PAGE dan diidentifikasi oleh western blotting atau spektrometri massa. Ko-IP dapat mendeteksi interaksi dalam kondisi dekat-fisiologis, tetapi dapat mengidentifikasi interaksi tidak langsung dan mungkin kehilangan interaksi lemah atau sementara. Penandaan epitop, di mana tag peptida seperti FLAG atau HA digabungkan ke protein umpan, memungkinkan penangkapan menggunakan antibodi tag yang dikarakterisasi dengan baik.
Pemurnian Afinitas Digabung dengan Spektrometri Massa
AP-MS menggabungkan pemurnian afinitas protein umpan bertanda dengan identifikasi spektrometri massa mitra interaksinya. Tag diekspresikan sebagai protein fusi dalam sel, dan kompleks protein dimurnikan dalam kondisi lembut menggunakan tag sebagai pegangan. Kompleks yang dimurnikan dicerna dengan tripsin, dan peptida diidentifikasi oleh spektrometri massa. Pemurnian kontrol dari sel tanpa tag membedakan interaktor spesifik dari kontaminan. AP-MS kuantitatif menggunakan SILAC atau metode bebas label memberikan diskriminasi tambahan.
Yeast Two-Hybrid
Sistem yeast two-hybrid mendeteksi interaksi protein-protein biner dalam sel ragi hidup. Protein umpan digabungkan ke domain pengikatan DNA dari faktor transkripsi, dan protein mangsa digabungkan ke domain aktivasi. Jika umpan dan mangsa berinteraksi, faktor transkripsi direkonstitusi, mengaktifkan ekspresi gen reporter. Y2H dapat diskalakan untuk penyaringan throughput tinggi, di mana protein umpan diuji terhadap pustaka protein mangsa. Namun, Y2H mendeteksi interaksi dalam nukleus ragi, yang mungkin tidak mencerminkan lingkungan alami protein, dan memiliki tingkat positif palsu dan negatif palsu yang tinggi.
Resonansi Plasmon Permukaan
Resonansi plasmon permukaan mengukur pengikatan waktu nyata antara protein yang diimobilisasi pada chip sensor dan mitra interaksinya dalam larutan. SPR memberikan informasi kinetik, termasuk konstanta laju asosiasi dan disosiasi, dari mana konstanta disosiasi kesetimbangan dihitung. Teknik ini bebas label dan dapat mengukur interaksi pada berbagai afinitas. SPR banyak digunakan dalam penemuan obat untuk mengkarakterisasi interaksi antibodi-antigen dan untuk menyaring inhibitor interaksi protein-protein.
Förster Resonance Energy Transfer
FRET mendeteksi interaksi protein-protein dalam sel hidup dengan mengukur transfer energi antara fluorofor donor dan akseptor yang melekat pada dua protein yang berinteraksi. Ketika protein berada dalam jarak 10 nanometer dan dalam orientasi yang benar, eksitasi donor menyebabkan emisi dari akseptor. FRET dapat diukur dengan mikroskop fluoresensi, memungkinkan analisis spasial dan temporal interaksi. Varian termasuk FRAP, yang mengukur mobilitas dan pengikatan protein, dan BRET, yang menggunakan donor bioluminesen untuk menghindari masalah pemutihan foto.
