Protein-Protein-Interaktionen sind die physikalischen Kontakte zwischen Proteinen, die allen zellulären Prozessen zugrunde liegen. Proteine wirken selten isoliert, sondern als Komponenten komplexer Interaktionsnetzwerke und bilden transiente oder stabile Komplexe, die biologische Funktionen ausführen.

Arten von Interaktionen

Protein-Protein-Interaktionen reichen von stabilen, permanenten Komplexen wie dem Ribosom oder Proteasom bis zu transienten Interaktionen, die sich als Reaktion auf Signale bilden und dissoziieren. Interaktionen können obligat sein, bei denen die Untereinheiten in Isolation instabil sind, oder nicht-obligat, bei denen die einzelnen Proteine für sich genommen stabil sind. Die Grenzflächen stabiler Komplexe sind tendenziell größer und hydrophober als die transienter Interaktionen, die oft polare und geladene Reste einbeziehen.

Interaktionsoberflächen

Protein-Protein-Grenzflächen vergraben typischerweise 600 bis 2000 Quadratangström zugänglicher Oberfläche. Die Grenzflächen sind angereichert mit hydrophoben Resten, die bei der Komplexbildung vergraben werden, und enthalten oft einen zentralen hydrophoben Fleck, umgeben von polaren Wechselwirkungen. Hot Spots sind Reste, die überproportional zur Bindungsenergie beitragen, typischerweise Tryptophan, Arginin und Tyrosin. Diese Hot-Spot-Reste sind von energetisch weniger wichtigen Resten umgeben, die Wasser von der Grenzfläche fernhalten.

Bindungsaffinität und Kinetik

Die Stärke einer Protein-Protein-Interaktion wird durch die Dissoziationskonstante beschrieben, die von picomolar für hochaffine Interaktionen bis mikromolar für schwache, transiente Interaktionen reichen kann. Der Kd-Wert wird durch die Assoziations- und Dissoziationsraten bestimmt. Assoziationsraten werden durch elektrostatische Steuerung beeinflusst, bei der komplementäre Ladungen auf den beiden Proteinen ihr Zusammentreffen beschleunigen. Dissoziationsraten bestimmen die Interaktionslebensdauer, wobei langsame Dissoziation langlebige Komplexe erzeugt und schnelle Dissoziation eine schnelle Signalbeendigung ermöglicht.

Co-Immunpräzipitation

Die Co-Immunpräzipitation ist eine weit verbreitete Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen. Ein Antikörper gegen ein Köderprotein wird verwendet, um es zusammen mit seinen Interaktionspartnern aus Zelllysaten einzufangen. Die präzipitierten Proteine werden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Western Blot oder Massenspektrometrie identifiziert. Co-IP kann Interaktionen unter nahezu physiologischen Bedingungen nachweisen, kann aber indirekte Interaktionen identifizieren und schwache oder transiente Interaktionen möglicherweise übersehen. Epitop-Markierung, bei der ein Peptid-Tag wie FLAG oder HA an das Köderprotein fusioniert wird, ermöglicht die Erfassung unter Verwendung gut charakterisierter Tag-Antikörper.

Affinitätsreinigung gekoppelt mit Massenspektrometrie

AP-MS kombiniert die Affinitätsreinigung eines markierten Köderproteins mit der massenspektrometrischen Identifizierung seiner Interaktionspartner. Der Tag wird als Fusionsprotein in Zellen exprimiert und der Proteinkomplex wird unter schonenden Bedingungen unter Verwendung des Tags als Anker gereinigt. Der gereinigte Komplex wird mit Trypsin verdaut und die Peptide werden durch Massenspektrometrie identifiziert. Kontrollreinigungen von nicht markierten Zellen unterscheiden spezifische Interaktoren von Kontaminanten. Quantitative AP-MS mit SILAC oder markierungsfreien Methoden bietet eine zusätzliche Unterscheidung.

Hefe-Zwei-Hybrid-System

Das Hefe-Zwei-Hybrid-System detektiert binäre Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen. Das Köderprotein wird mit der DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert und das Beuteprotein wird mit der Aktivierungsdomäne fusioniert. Wenn Köder und Beute interagieren, wird der Transkriptionsfaktor rekonstituiert und aktiviert die Reportergenexpression. Y2H ist für Hochdurchsatz-Screening skalierbar, bei dem ein Köderprotein gegen Bibliotheken von Beuteproteinen getestet wird. Y2H detektiert jedoch Interaktionen im Hefezellkern, was möglicherweise nicht die natürliche Umgebung der Proteine widerspiegelt, und hat hohe Raten falsch-positiver und falsch-negativer Ergebnisse.

Oberflächenplasmonenresonanz

Die Oberflächenplasmonenresonanz misst die Echtzeit-Bindung zwischen einem auf einem Sensorchip immobilisierten Protein und seinem Interaktionspartner in Lösung. SPR liefert kinetische Informationen, einschließlich Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten, aus denen die Gleichgewichtsdissoziationskonstante berechnet wird. Die Technik ist markierungsfrei und kann Interaktionen über einen weiten Affinitätsbereich messen. SPR wird in der Wirkstoffforschung häufig zur Charakterisierung von Antikörper-Antigen-Interaktionen und zum Screening von Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt.

Förster-Resonanzenergietransfer

FRET detektiert Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen durch Messung des Energietransfers zwischen einem Donor- und Akzeptorfluorophor, die an zwei interagierende Proteine gebunden sind. Wenn die Proteine innerhalb von 10 Nanometern und in der richtigen Orientierung sind, führt die Anregung des Donors zur Emission des Akzeptors. FRET kann durch Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden, was eine räumliche und zeitliche Analyse von Interaktionen ermöglicht. Varianten umfassen FRAP, das die Proteinmobilität und -bindung misst, und BRET, das biolumineszente Donoren verwendet, um Probleme mit Photobleichen zu vermeiden.