Sekuensing RNA (RNA-Seq) adalah teknik yang menggunakan sekuensing generasi berikutnya untuk menganalisis seluruh kumpulan transkrip RNA dalam sampel sel atau jaringan. Ini memberikan gambaran tentang ekspresi gen, mengungkapkan gen mana yang aktif dan pada tingkat apa.
Cara Kerja RNA-Seq
- Ekstraksi RNA
Total RNA diekstraksi dari sampel menggunakan metode yang mirip dengan isolasi DNA, tetapi dengan langkah tambahan untuk menjaga molekul RNA yang rapuh. Integritas RNA diperiksa menggunakan elektroforesis gel atau bioanalyzer.
- Pengayaan mRNA atau Depleksi rRNA
Karena RNA ribosom membentuk sebagian besar total RNA, ia dihilangkan untuk memperkaya RNA messenger (mRNA). Ini dilakukan menggunakan manik-manik poli-T yang menangkap ekor poli-A mRNA, atau dengan secara selektif mendepleksi sekuens RNA ribosom.
- Persiapan Pustaka
mRNA yang diperkaya difragmentasi menjadi potongan-potongan kecil dan ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer (cDNA) menggunakan primer acak. Adaptor diligasikan ke fragmen cDNA, dan pustaka diamplifikasi oleh PCR.
- Sekuensing
Pustaka cDNA disekuensing pada platform NGS, menghasilkan jutaan bacaan pendek. Setiap bacaan mewakili sekuens pendek dari satu ujung fragmen cDNA.
- Analisis Data
Bacaan diselaraskan ke genom referensi atau transkriptom. Jumlah bacaan yang dipetakan ke setiap gen dihitung untuk mengukur tingkat ekspresi. Analisis ekspresi diferensial mengidentifikasi gen yang secara signifikan naik atau turun regulasinya antar kondisi.
- Aplikasi
RNA-Seq digunakan untuk mempelajari perubahan ekspresi gen dalam perkembangan, penyakit, perawatan obat, dan respons lingkungan. Ia juga dapat mendeteksi penyambungan alternatif, transkrip baru, dan RNA non-kode.
