Ikhtisar
Pemanggilan varian adalah proses komputasi untuk mengidentifikasi perbedaan antara genom individu dan genom referensi. Perbedaan-perbedaan ini berkisar dari polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dan penyisipan atau penghapusan kecil (indels) hingga varian struktural besar seperti perubahan jumlah salinan dan penataan ulang kromosom. Deteksi varian yang akurat adalah landasan genetika manusia, pengobatan presisi, dan biologi evolusi. Proses ini memerlukan pemodelan statistik yang cermat untuk membedakan variasi biologis asli dari kesalahan pengurutan dan artefak penyelarasan.
Konsep Utama
Sebagian besar pemanggil varian mengikuti alur kerja yang umum: pembacaan sekuensing pertama-tama diselaraskan dengan genom referensi menggunakan alat seperti BWA atau Bowtie2, kemudian data yang diselaraskan diproses untuk mengidentifikasi posisi di mana urutan individu berbeda dari referensi. Perangkat analisis genom (GATK) jalur praktik terbaik diadopsi secara luas, menggunakan pendekatan Bayesian untuk menghitung kemungkinan genotipe. Pertimbangan utama mencakup kedalaman cakupan (kedalaman yang lebih tinggi meningkatkan kepercayaan diri), skor kualitas dasar, dan kualitas pemetaan. Pemfilteran varian menggunakan ambang batas keras atau pembelajaran mesin (misalnya, VQSR) menghilangkan positif palsu. Deteksi varian struktural memerlukan alat khusus seperti DELLY atau Manta yang menganalisis pasangan baca sumbang dan bacaan terpisah.
Aplikasi
Panggilan varian mendorong genomik klinis dan penelitian. Ini mengidentifikasi mutasi yang mendasari kelainan genetik langka dan menginformasikan genomik kanker dengan mengungkap mutasi somatik dalam perbandingan tumor-normal. Proyek skala populasi seperti Proyek 1000 Genom telah mengkatalogkan jutaan varian untuk memetakan keanekaragaman manusia. Pada penyakit menular, pemanggilan varian melacak evolusi patogen dan resistensi obat. Keakuratan pemanggilan varian pada dasarnya bergantung pada kualitas data pengurutan generasi berikutnya dan platform pengurutan DNA yang digunakan.
Protokol Praktis
Alur kerja Praktik Terbaik GATK untuk penemuan varian pendek germline berlangsung melalui beberapa tahap. Mulailah dengan file BAM yang disejajarkan dari BWA-MEM: bwa mem -t 8 -R "@RG\tID:sample\tSM:sample\tLB:lib\tPL:ILLUMINA" reference.fa sample_R1.fastq sample_R2.fastq > aligned.sam. Sortir dan konversikan ke BAM dengan samtools sort. Tandai duplikat menggunakan GATK MarkDuplications untuk menandai duplikat PCR, lalu indeks dengan samtools index. Kalibrasi ulang skor kualitas dasar (BQSR) mengoreksi kesalahan sistematis dalam kualitas dasar: pertama buat model kalibrasi ulang dengan Gatk BaseRecalibrator -R reference.fa -I dedup.bam --known-sites dbsnp.vcf -O recal.table, lalu terapkan dengan Gatk ApplyBQSR -R reference.fa -I dedup.bam --bqsr-recal-file recal.table -O ingat.bam. Pemanggilan varian pada sampel individual menggunakan Gatk HaplotypeCaller -R reference.fa -I recal.bam -O sample.g.vcf -ERC GVCF, yang menghasilkan gVCF untuk genotipe gabungan. Gabungkan sampel dengan Gatk GenomicsDBImport dan panggil bersama dengan Gatk GenotypeGVCFs -R reference.fa -V cohort.g.vcf -O raw_variants.vcf. Pemfilteran varian menggunakan Kalibrasi Ulang Skor Kualitas Varian (VQSR): Gatk VariantRecalibrator membuat model campuran Gaussian menggunakan situs kebenaran yang diketahui (HapMap, Omni, 1000G), dan Gatk ApplyVQSR menerapkan filter tranche (biasanya sensitivitas 99,0% untuk SNP, 99,5% untuk indel). Untuk deteksi varian struktural, jalankan Manta dengan skrip konfigurasinya diikuti dengan eksekusi alur kerja. Evaluasi rangkaian panggilan akhir dengan Gatk CollectVariantCallingMetrics dan periksa rasio transisi/transversi, Ti/Tv sekitar 2,0–2,1 menunjukkan kualitas tinggi untuk data seluruh genom manusia.
