A imunoprecipitação de cromatina é um método para mapear interações proteína-DNA no genoma. Ela identifica os sítios de ligação genômica de fatores de transcrição, histonas com modificações específicas e outras proteínas associadas à cromatina, fornecendo insights sobre regulação gênica e estrutura da cromatina.
Princípio Básico
O ChIP começa com a fixação de proteínas ao DNA em células vivas, tipicamente usando formaldeído que cria ligações cruzadas covalentes entre proteínas e DNA em poucos angstroms. A cromatina fixada é fragmentada em fragmentos de 200 a 600 pares de base por sonicação ou digestão enzimática. Um anticorpo específico para a proteína de interesse é usado para imunoprecipitar os complexos proteína-DNA. As ligações cruzadas são revertidas, e o DNA é purificado. Os fragmentos de DNA enriquecidos são então identificados por PCR quantitativo, microarranjo ou sequenciamento.
Fixação
A fixação com formaldeído é o método padrão, criando pontes metileno entre grupos amino próximos. É reversível por calor e eficaz para proteínas que contatam diretamente o DNA. Para proteínas que se ligam ao DNA indiretamente ou fracamente, fixadores alternativos como etileno glicol bis-succinimidil succinato podem ser usados. O ChIP nativo omite a fixação e funciona para proteínas firmemente ligadas, como histonas.
Fragmentação da Cromatina
A sonicação produz fragmentos aleatórios de DNA por cisalhamento mecânico. A distribuição do tamanho dos fragmentos é crítica, pois fragmentos menores fornecem maior resolução dos sítios de ligação. As condições de sonicação devem ser otimizadas para cada tipo celular para evitar fragmentação excessiva ou insuficiente. A digestão enzimática usando nuclease microcócica é uma alternativa para ChIP nativo, clivando o DNA entre os nucleossomos.
Imunoprecipitação
O sucesso do ChIP depende da qualidade do anticorpo. O anticorpo deve reconhecer seu alvo na cromatina fixada com alta especificidade e afinidade. Anticorpos grau ChIP são validados para esta aplicação. Esferas de agarose ou magnéticas com proteína A ou proteína G são usadas para capturar os complexos anticorpo-cromatina. Esferas magnéticas são preferidas por menor fundo e processamento mais rápido.
ChIP-qPCR
Para genes alvo conhecidos, o ChIP-qPCR (PCR quantitativo) quantifica o enriquecimento em regiões genômicas específicas. Iniciadores são desenhados para o sítio de ligação suspeito e para uma região de controle negativo. O enriquecimento é calculado como a dobra de aumento sobre o controle negativo ou a cromatina de entrada. O ChIP-qPCR é sensível, quantitativo e adequado para estudos orientados por hipóteses de loci selecionados.
ChIP-on-Chip
O ChIP baseado em microarranjo hibridiza o DNA enriquecido por ChIP a microarranjos de cobertura que cobrem regiões genômicas de interesse. O DNA de entrada é marcado com um fluoróforo e o DNA do ChIP com outro. Regiões genômicas com altas razões correspondem a sítios de ligação. A resolução é limitada pelo tamanho do fragmento e pelo espaçamento das sondas. O ChIP-on-chip foi amplamente substituído pelo ChIP-seq.
ChIP-Sequenciamento
O ChIP-seq combina ChIP com sequenciamento de próxima geração. Os fragmentos de DNA imunoprecipitados são sequenciados, e as leituras são alinhadas ao genoma de referência. Regiões com enriquecimento de leituras estatisticamente significativo, chamadas picos, indicam sítios de ligação proteica. O ChIP-seq fornece maior resolução, menor ruído e cobertura genômica completa sem exigir sondas pré-definidas. Algoritmos de chamada de picos como o MACS identificam regiões onde a densidade de leituras excede significativamente a distribuição de fundo.
Análise de Dados
A análise de dados de ChIP-seq começa com controle de qualidade, alinhamento de leituras e remoção de duplicatas de PCR. A chamada de picos identifica regiões enriquecidas usando um modelo de Poisson ou binomial negativo. A correção para testes múltiplos controla a taxa de falsa descoberta. A análise downstream inclui anotação de picos para genes próximos, descoberta de motivos para identificar preferências de sequência e comparação entre condições.
Aplicações
O ChIP-seq mapeia sítios de ligação de fatores de transcrição em todo o genoma, revelando as redes regulatórias que controlam a expressão gênica. Mapeia padrões de modificação de histonas que definem promotores ativos, potencializadores e cromatina reprimida. O ChIP-seq para RNA polimerase II identifica genes transcritos e polimerases pausadas. Os projetos ENCODE e Roadmap Epigenomics geraram milhares de conjuntos de dados de ChIP-seq, criando mapas abrangentes da paisagem regulatória do genoma humano.
