染色质免疫沉淀是一种在基因组中绘制蛋白质-DNA相互作用图谱的方法。它鉴定转录因子、具有特定修饰的组蛋白和其他染色质相关蛋白的基因组结合位点，为基因调控和染色质结构提供见解。

基本原理

ChIP首先在活细胞中将蛋白质与DNA交联，通常使用甲醛，它在蛋白质和DNA之间相距几埃的范围内产生共价交联。交联的染色质通过超声处理或酶促消化被剪切为200至600碱基对的片段。使用对目标蛋白特异的抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合物。逆转交联，纯化DNA。然后通过定量PCR、微阵列或测序鉴定富集的DNA片段。

交联

甲醛交联是标准方法，在紧密相互作用的氨基之间产生亚甲基桥。它可通过加热逆转，对直接接触DNA的蛋白质有效。对于间接或弱结合DNA的蛋白质，可以使用替代交联剂如乙二醇双琥珀酰亚胺琥珀酸酯。天然ChIP省略交联，适用于紧密结合的蛋白质如组蛋白。

染色质剪切

超声处理通过机械剪切产生随机DNA片段。片段大小分布至关重要，因为较小的片段提供更高分辨率的结合位点。超声处理条件必须针对每种细胞类型优化，以避免过度剪切或剪切不足。使用微球菌核酸酶的酶促消化是天然ChIP的替代方法，在核小体之间切割DNA。

免疫沉淀

ChIP的成功取决于抗体质量。抗体必须以其高特异性和亲和力识别交联染色质中的靶标。ChIP级别的抗体经过验证可用于此应用。蛋白A或蛋白G琼脂糖或磁珠用于捕获抗体-染色质复合物。磁珠因其较低背景和更快处理而更受青睐。

ChIP-qPCR

对于已知靶基因，ChIP-qPCR（定量PCR）量化在特定基因组区域的富集。引物针对假定的结合位点和阴性对照区域设计。富集计算为相对于阴性对照或输入染色质的倍数增加。ChIP-qPCR灵敏、定量，适用于假设驱动的选定基因座研究。

ChIP-on-Chip

基于微阵列的ChIP将ChIP富集的DNA杂交到覆盖感兴趣基因组区域的 tiling 微阵列。输入DNA用一种荧光团标记，ChIP DNA用另一种标记。高比率的基因组区域对应结合位点。分辨率受片段大小和探针间距限制。ChIP-on-chip已 largely 被ChIP-seq取代。

ChIP测序

ChIP-seq将ChIP与下一代测序结合。免疫沉淀的DNA片段被测序，reads比对到参考基因组。具有统计学显著read富集的区域（称为峰）指示蛋白质结合位点。ChIP-seq提供更高的分辨率、更低的噪声和全基因组覆盖，无需预先定义的探针。峰值检测算法如MACS识别read密度显著超过背景分布的区域。

数据分析

ChIP-seq数据分析始于质量控制、read比对和去除PCR重复。峰值检测使用泊松或负二项模型识别富集区域。多重检验校正控制假发现率。下游分析包括将峰注释到附近基因、发现基序以识别序列偏好以及跨条件比较。

应用

ChIP-seq在全基因组范围内绘制转录因子结合位点，揭示控制基因表达的调控网络。它绘制定义活性启动子、增强子和抑制性染色质的组蛋白修饰模式。针对RNA聚合酶II的ChIP-seq识别转录基因和暂停的聚合酶。ENCODE和Roadmap Epigenomics项目生成了数千个ChIP-seq数据集，创建了人类基因组调控景观的综合图谱。