La inmunoprecipitación de cromatina es un método para mapear interacciones proteína-ADN en el genoma. Identifica los sitios de unión genómicos de factores de transcripción, histonas con modificaciones específicas y otras proteínas asociadas a la cromatina, proporcionando información sobre la regulación génica y la estructura de la cromatina.
Principio Básico
ChIP comienza con el entrecruzamiento de proteínas al ADN en células vivas, típicamente usando formaldehído que crea entrecruzamientos covalentes entre proteínas y ADN dentro de unos angstroms. La cromatina entrecruzada se fragmenta en fragmentos de 200 a 600 pares de bases mediante sonicación o digestión enzimática. Se usa un anticuerpo específico para la proteína de interés para inmunoprecipitar los complejos proteína-ADN. Los entrecruzamientos se revierten, y el ADN se purifica. Los fragmentos de ADN enriquecidos luego se identifican mediante PCR cuantitativa, microarreglo o secuenciación.
Entrecruzamiento
El entrecruzamiento con formaldehído es el método estándar, creando puentes de metileno entre grupos amino que interactúan estrechamente. Es reversible por calor y es efectivo para proteínas que contactan directamente el ADN. Para proteínas que se unen al ADN indirecta o débilmente, se pueden usar entrecruzadores alternativos como el succinimidyl succinate de etilenglicol bis. El ChIP nativo omite el entrecruzamiento y funciona para proteínas fuertemente unidas como las histonas.
Fragmentación de la Cromatina
La sonicación produce fragmentos de ADN aleatorios mediante cizallamiento mecánico. La distribución del tamaño de los fragmentos es crítica, ya que fragmentos más pequeños proporcionan mayor resolución de los sitios de unión. Las condiciones de sonicación deben optimizarse para cada tipo celular para evitar la fragmentación excesiva o insuficiente. La digestión enzimática usando nucleasa micrococal es una alternativa para ChIP nativo, escindiendo el ADN entre nucleosomas.
Inmunoprecipitación
El éxito de ChIP depende de la calidad del anticuerpo. El anticuerpo debe reconocer su diana en cromatina entrecruzada con alta especificidad y afinidad. Los anticuerpos de grado ChIP están validados para esta aplicación. Se usan agarosa o perlas magnéticas con proteína A o proteína G para capturar los complejos anticuerpo-cromatina. Las perlas magnéticas son preferidas por su menor fondo y procesamiento más rápido.
ChIP-qPCR
Para genes diana conocidos, ChIP-qPCR (PCR cuantitativa) cuantifica el enriquecimiento en regiones genómicas específicas. Los cebadores se diseñan para el sitio de unión sospechoso y para una región de control negativo. El enriquecimiento se calcula como el aumento de pliegue sobre el control negativo o la cromatina de entrada. ChIP-qPCR es sensible, cuantitativo y adecuado para estudios basados en hipótesis de loci seleccionados.
ChIP-on-Chip
El ChIP basado en microarreglos hibrida el ADN enriquecido por ChIP a microarreglos de cobertura que cubren regiones genómicas de interés. El ADN de entrada se marca con un fluoróforo y el ADN de ChIP con otro. Las regiones genómicas con altas relaciones corresponden a sitios de unión. La resolución está limitada por el tamaño del fragmento y el espaciado de las sondas. ChIP-on-chip ha sido reemplazado en gran medida por ChIP-seq.
ChIP-Sequenciación
ChIP-seq combina ChIP con secuenciación de próxima generación. Los fragmentos de ADN inmunoprecipitados se secuencian, y las lecturas se alinean al genoma de referencia. Las regiones con enriquecimiento de lecturas estadísticamente significativo, llamados picos, indican sitios de unión de proteínas. ChIP-seq proporciona mayor resolución, menor ruido y cobertura de todo el genoma sin requerir sondas predefinidas. Los algoritmos de llamada de picos como MACS identifican regiones donde la densidad de lecturas excede significativamente la distribución de fondo.
Análisis de Datos
El análisis de datos de ChIP-seq comienza con control de calidad, alineación de lecturas y eliminación de duplicados de PCR. La llamada de picos identifica regiones enriquecidas usando un modelo de Poisson o binomial negativo. La corrección de pruebas múltiples controla la tasa de falsos descubrimientos. El análisis posterior incluye anotación de picos a genes cercanos, descubrimiento de motivos para identificar preferencias de secuencia y comparación entre condiciones.
Aplicaciones
ChIP-seq mapea sitios de unión de factores de transcripción en todo el genoma, revelando las redes reguladoras que controlan la expresión génica. Mapea patrones de modificación de histonas que definen promotores activos, potenciadores y cromatina reprimida. ChIP-seq para ARN polimerasa II identifica genes transcritos y polimerasas en pausa. Los proyectos ENCODE y Roadmap Epigenomics generaron miles de conjuntos de datos ChIP-seq, creando mapas completos del panorama regulatorio del genoma humano.
