A tecnologia CRISPR expandiu-se muito além da edição genômica com Cas9 para incluir edição de bases, edição prime, regulação gênica e aplicações diagnósticas. Esses avanços transformaram a biologia molecular, a biotecnologia e a medicina.

Além do Cas9: O Kit de Ferramentas CRISPR

Os sistemas CRISPR-Cas são sistemas imunes adaptativos em bactérias e arqueias, e seus componentes foram adaptados para diversas aplicações. O Cas9 de Streptococcus pyogenes foi a primeira enzima de edição amplamente utilizada, criando quebras de fita dupla guiadas por um RNA guia único. O Cas12a, anteriormente chamado Cpf1, cria cortes escalonados e processa seu próprio pré-crRNA, simplificando a multiplexação. O Cas13 tem como alvo o RNA em vez do DNA e tem atividade de clivagem colateral. O Cas14 tem como alvo DNA de fita simples.

Interferência por CRISPR

O Cas9 cataliticamente morto, que tem mutações em ambos os domínios de nuclease, retém a ligação ao DNA, mas não pode cortar. A fusão de dCas9 a domínios repressores como KRAB cria CRISPRi, que silencia a expressão gênica ao bloquear o início ou alongamento da transcrição. Diferentemente da interferência por RNA, o CRISPRi funciona no nível do DNA, produzindo repressão mais completa e específica.

O CRISPRi é altamente específico com efeitos mínimos fora do alvo. Pode ser usado em células bacterianas e de mamíferos e é reversível quando a expressão de dCas9 é desligada. Visar o promotor ou as primeiras centenas de pares de base da sequência codificante produz a repressão mais forte. O CRISPRi multiplexado com múltiplos RNAs guia pode reprimir simultaneamente vários genes.

Ativação por CRISPR

O dCas9 fusionado a domínios ativadores como VP64 ou VPR cria CRISPRa, que ativa a expressão gênica endógena. A ativação mais forte usa o sistema de mediador de ativação sinérgica, onde múltiplos domínios ativadores são recrutados ao promotor alvo através de interações anticorpo-epítopo. O CRISPRa ativa a expressão gênica a partir do contexto genômico natural, preservando splicing e elementos regulatórios.

O CRISPRa pode ativar genes que de outra forma estão silenciosos em um tipo celular, permitindo estudos funcionais de genes sem clonar cDNAs. Tem sido usado para identificar genes que conferem resistência a fármacos, reprogramar identidade celular e triar genes envolvidos em processos biológicos específicos. Triagens CRISPRa usam bibliotecas de RNA guia visando todos os promotores conhecidos.

Edição de Bases

A edição de bases converte diretamente uma base de DNA em outra sem criar uma quebra de fita dupla. Os editores de base de citosina fundem uma citidina deaminase a uma Cas9 nicking, convertendo C em T dentro de uma janela de edição de 5 nucleotídeos. Os editores de base de adenina convertem A em G usando uma deaminase projetada. A nicking cria um nick de fita simples na fita não editada, promovendo o reparo usando a fita editada como molde.

A edição de bases é altamente eficiente e produz menos resultados indesejados que a edição com Cas9. Não pode introduzir edições arbitrárias, mas pode corrigir cerca de 60% das mutações pontuais associadas a doenças. BE4 e ABE7.10 são editores de base otimizados com eficiência melhorada e edição fora do alvo reduzida. A edição de bases foi aplicada em organismos modelo, plantas e terapia gênica pré-clínica.

Edição Prime

A edição prime usa uma Cas9 nicking fusionada a uma transcriptase reversa, juntamente com um RNA guia de edição prime que especifica tanto o sítio alvo quanto codifica a edição desejada. O pegRNA inclui um sítio de ligação do iniciador e um molde de transcrição reversa contendo a edição. Após a nicking da fita alvo, o molde de RT é usado para sintetizar DNA editado. Vias de reparo celular incorporam a sequência editada.

A edição prime pode instalar todas as substituições de nucleotídeo único possíveis, bem como pequenas inserções e deleções, sem exigir uma quebra de fita dupla ou molde doador. A edição fora do alvo é menor que com Cas9 ou editores de base. As eficiências da edição prime variam por sítio alvo e tipo celular, e a otimização contínua visa melhorar a entrega e a atividade.

Diagnósticos com CRISPR

Cas12 e Cas13 têm atividade de clivagem colateral: após o reconhecimento de seu ácido nucleico alvo, eles clivam inespecificamente DNA ou RNA de fita simples próximos. Esta propriedade foi aproveitada para diagnósticos moleculares. O DETECTR usa Cas12a e o SHERLOCK usa Cas13 para detectar sequências específicas de ácido nucleico.

Quando a sequência alvo está presente, a clivagem colateral de uma molécula repórter gera um sinal fluorescente ou colorimétrico. Esses sistemas alcançam sensibilidade attomolar e podem distinguir variantes de nucleotídeo único. Diagnósticos com CRISPR foram desenvolvidos para detecção viral incluindo SARS-CoV-2, Zika e dengue, com resultados lidos em menos de uma hora sem equipamento complexo.

Triagem com CRISPR

Bibliotecas CRISPR visando milhares de genes permitem triagens funcionais em escala genômica. Bibliotecas de RNA guia são entregues a um pool de células, e o efeito de cada knockout é medido pelo enriquecimento ou depleção do RNA guia usando PCR. Triagens de seleção positiva identificam genes cujo knockout confere vantagem de crescimento. Triagens de seleção negativa identificam genes essenciais para a sobrevivência celular. Triagens CRISPR têm maior sensibilidade e menor ruído que triagens de RNAi.