Teknologi CRISPR telah berkembang jauh melampaui pengeditan genom dengan Cas9 hingga mencakup pengeditan basa, pengeditan utama, regulasi gen, dan aplikasi diagnostik. Kemajuan ini telah mengubah biologi molekuler, bioteknologi, dan kedokteran.

Di Luar Cas9: Perlengkapan CRISPR

Sistem CRISPR-Cas adalah sistem imun adaptif pada bakteri dan archaea, dan komponennya telah diadaptasi untuk berbagai aplikasi. Cas9 dari Streptococcus pyogenes adalah enzim pengeditan pertama yang banyak digunakan, menciptakan patahan untai ganda yang dipandu oleh RNA pemandu tunggal. Cas12a, sebelumnya disebut Cpf1, menciptakan potongan bergerigi dan memproses pre-crRNA sendiri, menyederhanakan multipleksing. Cas13 menargetkan RNA daripada DNA dan memiliki aktivitas pembelahan kolateral. Cas14 menargetkan DNA untai tunggal.

Interferensi CRISPR

Cas9 mati secara katalitik, yang memiliki mutasi di kedua domain nuklease, mempertahankan pengikatan DNA tetapi tidak dapat memotong. Fusi dCas9 ke domain represor seperti KRAB menciptakan CRISPRi, yang membungkam ekspresi gen dengan memblokir inisiasi atau elongasi transkripsi. Tidak seperti interferensi RNA, CRISPRi bekerja pada tingkat DNA, menghasilkan represi yang lebih lengkap dan spesifik.

CRISPRi sangat spesifik dengan efek di luar target yang minimal. Ini dapat digunakan dalam sel bakteri dan mamalia dan bersifat reversibel ketika ekspresi dCas9 dimatikan. Menargetkan promotor atau beberapa ratus pasangan basa pertama dari sekuens pengkode menghasilkan represi terkuat. CRISPRi multipleks dengan beberapa RNA pemandu dapat secara bersamaan merepresi beberapa gen.

Aktivasi CRISPR

dCas9 yang digabungkan ke domain aktivator seperti VP64 atau VPR menciptakan CRISPRa, yang mengaktifkan ekspresi gen endogen. Aktivasi terkuat menggunakan sistem mediator aktivasi sinergis, di mana beberapa domain aktivator direkrut ke promotor target melalui interaksi antibodi-epitop. CRISPRa mengaktifkan ekspresi gen dari konteks genomik alami, mempertahankan penyambungan dan elemen pengatur.

CRISPRa dapat mengaktifkan gen yang sebaliknya diam dalam tipe sel, memungkinkan studi fungsional gen tanpa mengkloning cDNA. Ini telah digunakan untuk mengidentifikasi gen yang memberikan resistensi obat, memprogram ulang identitas sel, dan menyaring gen yang terlibat dalam proses biologis spesifik. Skrining CRISPRa menggunakan pustaka RNA pemandu yang menargetkan semua promotor yang diketahui.

Pengeditan Basa

Pengeditan basa langsung mengubah satu basa DNA menjadi basa lain tanpa menciptakan patahan untai ganda. Editor basa sitosin menggabungkan sitidin deaminase ke Cas9 nickase, mengubah C menjadi T dalam jendela pengeditan 5 nukleotida. Editor basa adenin mengubah A menjadi G menggunakan deaminase rekayasa. Nickase menciptakan takik untai tunggal pada untai yang tidak diedit, mendorong perbaikan menggunakan untai yang diedit sebagai templat.

Pengeditan basa sangat efisien dan menghasilkan hasil yang tidak diinginkan lebih sedikit daripada pengeditan Cas9. Ini tidak dapat memperkenalkan pengeditan arbitrer tetapi dapat memperbaiki sekitar 60% mutasi titik terkait penyakit. BE4 dan ABE7.10 adalah editor basa yang dioptimalkan dengan efisiensi yang ditingkatkan dan pengeditan di luar target yang berkurang. Pengeditan basa telah diterapkan pada organisme model, tanaman, dan terapi gen preklinis.

Pengeditan Utama

Pengeditan utama menggunakan Cas9 nickase yang digabungkan ke transkriptase balik, bersama dengan RNA pemandu pengeditan utama yang menentukan situs target dan menyandikan pengeditan yang diinginkan. PegRNA mencakup situs pengikatan primer dan templat transkripsi balik yang mengandung pengeditan. Setelah pembuatan takik pada untai target, templat RT digunakan untuk mensintesis DNA yang diedit. Jalur perbaikan seluler menggabungkan sekuens yang diedit.

Pengeditan utama dapat memasang semua substitusi nukleotida tunggal, serta insersi dan delesi kecil, tanpa memerlukan patahan untai ganda atau templat donor. Pengeditan di luar target lebih rendah daripada Cas9 atau editor basa. Efisiensi pengeditan utama bervariasi menurut situs target dan tipe sel, dan optimasi yang berkelanjutan bertujuan untuk meningkatkan pengiriman dan aktivitas.

Diagnostik CRISPR

Cas12 dan Cas13 memiliki aktivitas pembelahan kolateral: setelah mengenali asam nukleat targetnya, mereka secara non-spesifik membelah DNA untai tunggal atau RNA di dekatnya. Sifat ini telah dimanfaatkan untuk diagnostik molekuler. DETECTR menggunakan Cas12a dan SHERLOCK menggunakan Cas13 untuk mendeteksi sekuens asam nukleat spesifik.

Ketika sekuens target ada, pembelahan kolateral molekul reporter menghasilkan sinyal fluoresen atau kolorimetri. Sistem ini mencapai sensitivitas attomolar dan dapat membedakan varian nukleotida tunggal. Diagnostik CRISPR telah dikembangkan untuk deteksi virus termasuk SARS-CoV-2, Zika, dan dengue, dengan hasil terbaca dalam waktu kurang dari satu jam tanpa peralatan kompleks.

Skrining CRISPR

Pustaka CRISPR yang menargetkan ribuan gen memungkinkan skrining fungsional skala genom. Pustaka RNA pemandu dikirim ke kumpulan sel, dan efek setiap knockout diukur dengan pengayaan atau penipisan RNA pemandu menggunakan PCR. Skrining seleksi positif mengidentifikasi gen yang knockout-nya memberikan keuntungan pertumbuhan. Skrining seleksi negatif mengidentifikasi gen yang penting untuk kelangsungan hidup sel. Skrining CRISPR memiliki sensitivitas lebih tinggi dan kebisingan lebih rendah daripada skrining RNAi.