La tecnología CRISPR se ha expandido mucho más allá de la edición genómica con Cas9 para incluir edición de bases, edición primitiva, regulación génica y aplicaciones de diagnóstico. Estos avances han transformado la biología molecular, la biotecnología y la medicina.

Más Allá de Cas9: El Kit de Herramientas CRISPR

Los sistemas CRISPR-Cas son sistemas inmunes adaptativos en bacterias y arqueas, y sus componentes se han adaptado para diversas aplicaciones. Cas9 de Streptococcus pyogenes fue la primera enzima de edición ampliamente utilizada, creando roturas de doble cadena guiadas por un ARN guía único. Cas12a, anteriormente llamada Cpf1, crea cortes escalonados y procesa su propio pre-ARNcr, simplificando la multiplexación. Cas13 se dirige al ARN en lugar del ADN y tiene actividad de escisión colateral. Cas14 se dirige al ADN de cadena sencilla.

Interferencia CRISPR

La Cas9 catalíticamente muerta, que tiene mutaciones en ambos dominios nucleasa, retiene la unión al ADN pero no puede cortar. La fusión de dCas9 a dominios represores como KRAB crea CRISPRi, que silencia la expresión génica bloqueando el inicio o la elongación de la transcripción. A diferencia de la interferencia de ARN, CRISPRi funciona a nivel del ADN, produciendo una represión más completa y específica.

CRISPRi es altamente específico con efectos mínimos fuera del objetivo. Puede usarse en células bacterianas y de mamíferos y es reversible cuando se apaga la expresión de dCas9. La orientación al promotor o a los primeros cientos de pares de bases de la secuencia codificante produce la represión más fuerte. CRISPRi multiplexado con múltiples ARN guía puede reprimir simultáneamente varios genes.

Activación CRISPR

dCas9 fusionada a dominios activadores como VP64 o VPR crea CRISPRa, que activa la expresión génica endógena. La activación más fuerte usa el sistema de activación mediador sinérgico, donde múltiples dominios activadores son reclutados al promotor diana a través de interacciones anticuerpo-epítopo. CRISPRa activa la expresión génica desde el contexto genómico natural, preservando los elementos de splicing y regulación.

CRISPRa puede activar genes que de otro modo están silenciosos en un tipo celular, permitiendo estudios funcionales de genes sin clonar ADNc. Se ha utilizado para identificar genes que confieren resistencia a fármacos, reprogramar la identidad celular y cribar genes involucrados en procesos biológicos específicos. Los cribados CRISPRa usan bibliotecas de ARN guía que se dirigen a todos los promotores conocidos.

Edición de Bases

La edición de bases convierte directamente una base de ADN en otra sin crear una rotura de doble cadena. Los editores de bases de citosina fusionan una citidina desaminasa a una Cas9 nickasa, convirtiendo C en T dentro de una ventana de edición de 5 nucleótidos. Los editores de bases de adenina convierten A en G usando una desaminasa diseñada. La nickasa crea una mella de una sola cadena en la hebra no editada, promoviendo la reparación utilizando la hebra editada como molde.

La edición de bases es altamente eficiente y produce menos resultados no deseados que la edición con Cas9. No puede introducir ediciones arbitrarias pero puede corregir aproximadamente el 60% de las mutaciones puntuales asociadas a enfermedades. BE4 y ABE7.10 son editores de bases optimizados con eficiencia mejorada y edición fuera del objetivo reducida. La edición de bases se ha aplicado en organismos modelo, plantas y terapia génica preclínica.

Edición Primitiva

La edición primitiva usa una Cas9 nickasa fusionada a una transcriptasa inversa, junto con un ARN guía de edición primitiva que tanto especifica el sitio diana como codifica la edición deseada. El ARNpeg incluye un sitio de unión al cebador y una plantilla de transcripción inversa que contiene la edición. Después de mellar la hebra diana, la plantilla de RT se usa para sintetizar ADN editado. Las rutas de reparación celular incorporan la secuencia editada.

La edición primitiva puede instalar todas las sustituciones posibles de un solo nucleótido, así como pequeñas inserciones y deleciones, sin requerir una rotura de doble cadena ni una plantilla donante. La edición fuera del objetivo es menor que con Cas9 o los editores de bases. Las eficiencias de edición primitiva varían según el sitio diana y el tipo celular, y la optimización en curso tiene como objetivo mejorar la administración y la actividad.

Diagnósticos CRISPR

Cas12 y Cas13 tienen actividad de escisión colateral: después del reconocimiento de su ácido nucleico diana, escinden de forma no específica ADN o ARN monocatenario cercano. Esta propiedad se ha aprovechado para diagnósticos moleculares. DETECTR usa Cas12a y SHERLOCK usa Cas13 para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos.

Cuando la secuencia diana está presente, la escisión colateral de una molécula reportera genera una señal fluorescente o colorimétrica. Estos sistemas logran sensibilidad attomolar y pueden distinguir variantes de un solo nucleótido. Los diagnósticos CRISPR se han desarrollado para la detección viral incluyendo SARS-CoV-2, Zika y dengue, con resultados leídos en menos de una hora sin equipo complejo.

Cribado CRISPR

Las bibliotecas CRISPR que se dirigen a miles de genes permiten cribados funcionales a escala genómica. Las bibliotecas de ARN guía se administran a un grupo de células, y el efecto de cada knockout se mide mediante el enriquecimiento o agotamiento del ARN guía usando PCR. Los cribados de selección positiva identifican genes cuyo knockout confiere una ventaja de crecimiento. Los cribados de selección negativa identifican genes esenciales para la supervivencia celular. Los cribados CRISPR tienen mayor sensibilidad y menor ruido que los cribados de ARNi.