CRISPR/Cas9 é uma tecnologia revolucionária de edição genética que permite aos cientistas fazer alterações precisas no DNA dos organismos vivos. Originalmente descoberto como um sistema imunológico bacteriano, foi adaptado para se tornar uma ferramenta versátil para pesquisa genética, medicina e biotecnologia.
Como funciona o CRISPR/Cas9
- Guia de design de RNA
Um pequeno RNA guia (gRNA) é projetado para ser complementar à sequência de DNA alvo. O gRNA tem aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento e determina onde a enzima Cas9 irá cortar. A sequência alvo deve ser seguida diretamente por uma sequência de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM), tipicamente NGG.
- Formação Complexa
O gRNA é combinado com a proteína Cas9, formando um complexo ribonucleoproteico. O gRNA atua como um GPS, guiando Cas9 para a localização exata no genoma que corresponde à sequência do gRNA.
- Ligação e Clivagem de DNA
O complexo Cas9-gRNA varre o DNA em busca da sequência PAM. Uma vez encontrado, Cas9 desenrola o DNA e verifica se a sequência adjacente corresponde ao gRNA. Se corresponder, Cas9 cria uma quebra de fita dupla no DNA.
- Reparo de DNA
Os mecanismos naturais de reparação da célula assumem o controle. Existem dois caminhos principais:
- Junção de extremidades não homólogas (NHEJ): As extremidades quebradas são reunidas diretamente, muitas vezes causando pequenas inserções ou deleções que perturbam o gene.
- Reparo dirigido por homologia (HDR): Se um modelo de reparo for fornecido, a célula o utiliza para fazer edições precisas ou inserir novo material genético.
- Verificação
As células ou organismos editados são analisados por PCR e sequenciados para confirmar que a modificação genética desejada foi bem-sucedida.
Projeto prático de experimento CRISPR
Projete o RNA guia usando uma ferramenta on-line como CRISPick (Broad Institute) ou CHOPCHOP. Insira a sequência do gene alvo e selecione o gRNA de maior classificação com locais mínimos previstos fora do alvo (pontuação baixa no MIT). Encomende o gRNA como dois oligonucleotídeos complementares com saliências para clonagem em um vetor de expressão (por exemplo, pX459 para seleção de SpCas9 e puromicina) ou compre um gRNA transcrito in vitro e proteína Cas9 recombinante para entrega RNP. Para a formação de RNP, misture 100 pmol de proteína Cas9 com 120 pmol de gRNA em 10 μL de PBS, incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Entregue o RNP em células 2 × 10 ^ 5 por eletroporação usando um sistema Neon ou Lonza com o programa recomendado para o tipo de célula. Após 48 horas, extraia o DNA genômico e amplifique por PCR a região alvo (300–600 pb centrado no local do corte). Sanger sequencia o produto de PCR e analisa o cromatograma usando o software ICE (Inference of CRISPR Edits) ou TIDE, essas ferramentas decompõem os traços mistos para quantificar a eficiência da edição (porcentagem de indel) e identificar as edições mais comuns. Um experimento típico bem-sucedido produz eficiência de edição de 30 a 80% em células HEK293T. Para edição precisa mediada por HDR, co-entregue um modelo de reparo de oligodesoxinucleotídeo de fita simples (ssODN) (100-200 nt, com braços de homologia de 50 nt em cada lado) a 10 pmol por reação.
Aplicação no mundo real
Em estudos knockout do gene TP53 em células HCT116, um gRNA direcionado ao exon 4 é projetado via CRISPick. A eletroporação RNP atinge 65% de eficiência de edição por análise ICE. A clonagem unicelular isola um clone knockout homozigoto confirmado pelo sequenciamento Sanger mostrando uma deleção de 2 pb causando uma mudança de quadro e um códon de parada prematuro. Western blot confirma ausência da proteína p53.
