显微镜在微生物学中至关重要，用于观察肉眼无法看到的微生物。不同的显微镜技术提供不同水平的分辨率、对比度和结构信息。
光学显微镜
- 明场显微镜：最基本的形式，光线穿过染色标本。通过结晶紫、亚甲蓝或革兰氏染色等染料提供对比度。
- 相差显微镜：将折射率差异转化为对比度差异，可观察活的未染色细胞。适用于观察细菌运动性、细胞分裂和内生芽孢。
- 暗场显微镜：使用特殊聚光器以斜射光照射标本，使物体在暗背景下呈亮色。用于观察梅毒螺旋体等纤细细菌。
荧光显微镜
- 使用荧光染料（荧光色素），在较短波长的光源激发下发射特定波长的光。
- DAPI染色DNA（蓝色荧光），FITC标记抗体（绿色荧光），罗丹明标记细胞结构（红色荧光）。
- 免疫荧光：与荧光素偶联的抗体特异性结合靶抗原，可检测病原体（如军团菌、衣原体）和细胞组分。
- GFP（绿色荧光蛋白）标记可在活细胞中可视化蛋白质定位和动态。
电子显微镜
- 透射电子显微镜（TEM）：电子束穿过超薄标本切片。分辨率可达0.1 nm，可观察病毒颗粒、细胞内结构和蛋白质复合物。样品需要固定、包埋、切片和重金属染色（乙酸双氧铀、四氧化锇）。
- 扫描电子显微镜（SEM）：电子束扫描标本表面，检测次级电子以产生三维形貌图像。分辨率1-10 nm。用于观察细菌表面结构、生物膜和微生物群落。
共聚焦显微镜
- 使用针孔光阑消除离焦光，在厚标本中生成清晰的光学切片。
- 可三维重建微生物生物膜、组织切片和细胞内结构。
- 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）可使用不同荧光染料同时进行多通道成像。
标本制备
- 湿封片：将一滴液体培养物置于载玻片上，用于观察活微生物和运动性。
- 固定涂片：细菌通过热固定或甲醇固定在载玻片上，染色后在明场显微镜下观察。
- 负染色：印度墨汁或苯胺黑染色背景，未染色细胞呈透明区域可见。适用于荚膜观察。
- 革兰氏染色：细菌学中最重要的鉴别染色，将细菌分为革兰氏阳性或革兰氏阴性。
分辨率和放大倍数
- 光学显微镜的分辨率极限约为0.2 µm（阿贝衍射极限），由光波长和物镜数值孔径决定。
- 光学显微镜的最大有效放大倍数约为1000-1500倍。
- 电子显微镜由于电子波长较短（100 kV下为0.0037 nm）而实现更高的分辨率。
