定点突变向DNA序列引入特定的靶向变化，从而能够研究蛋白质功能、工程化具有改进特性的酶以及创建疾病模型。它是分子生物学中最重要的工具之一。

引物延伸法

最常用的方法使用含有所需突变的诱变寡核苷酸引物，两侧是与靶DNA互补的序列。引物退火到单链模板上，DNA聚合酶延伸以产生完整的双链分子。原始链来自野生型模板，而新合成链携带突变。

需要对抗亲本链的选择以富集突变体。在经典的Kunkel方法中，模板在dut- ung-细菌菌株中生长，该菌株掺入尿嘧啶代替胸腺嘧啶。体外合成后，含尿嘧啶的模板被尿嘧啶-DNA糖苷酶降解，留下完整的新合成突变链。商业试剂盒使用DpnI限制性内切酶（切割甲基化DNA）消化细菌来源的模板，同时留下含突变的体外合成链。

基于PCR的诱变

重叠延伸PCR使用两轮扩增。第一轮，两个独立的PCR反应扩增靶基因的重叠片段。一个引物对包含突变，片段末端在突变位点重叠。第二轮，两个片段混合并作为模板，使用外部引物进行PCR，产生含有突变的全长产物。该方法需要精心设计引物，但高效且不需要单链模板。

全质粒诱变在双链质粒模板上使用一对互补的诱变引物。高保真DNA聚合酶在PCR反应中扩增整个质粒，甲基化模板用DpnI消化。反应转化到大肠杆菌中，切口环状DNA在此修复。该方法简单，广泛用于引入点突变、插入和缺失。

在蛋白质工程中的应用

定点突变允许系统研究蛋白质结构-功能关系。丙氨酸扫描将一个感兴趣的区域的每个残基突变为丙氨酸，去除β碳以外的侧链。突变蛋白的分析揭示哪些残基对功能重要。该方法已用于绘制酶活性位点、鉴定配体结合残基以及确定单个氨基酸对蛋白质稳定性的贡献。

盒式突变用含有随机序列的合成寡核苷酸盒替换基因的短片段。饱和诱变在选定位置引入所有可能的氨基酸替换，创建可筛选改进功能的文库。定向进化将随机诱变与选择或筛选相结合，生成具有增强特性的蛋白质，如增加的热稳定性、改变的底物特异性或改进的催化活性。

疾病建模

定点突变用于创建人类遗传性疾病的动物模型。CRISPR-Cas9系统大大加速了这一过程，允许将特定突变引入小鼠、大鼠、斑马鱼和其他生物的基因组。这些模型重现人类疾病表型，用于研究疾病机制和测试潜在疗法。可以引入与患者中发现的相应的点突变以研究基因型-表型关联。

局限性

定点突变可能产生意外结果。预期突变可能影响蛋白质折叠而非正在研究的特定功能。突变可以不可预测的方式破坏局部结构，突变表型的解释必须考虑间接效应。对照实验（如以野生型水平表达突变蛋白并通过圆二色性或其他方法确认正确折叠）对于严格解释至关重要。

盒式突变和基因合成

现代基因合成允许以递减的成本生产定制DNA序列，使得无需基于PCR的方法即可生成大量突变体。合成基因可以设计为具有优化密码子、引入的限制性位点和多个突变。可以通过组装合成寡核苷酸生成组合文库。这种方法正在逐渐取代传统的定点突变，用于需要许多变体的应用，如工程化抗体或优化代谢途径。