Mutagenesis terarah situs memperkenalkan perubahan spesifik dan tertarget pada sekuens DNA, memungkinkan studi fungsi protein, rekayasa enzim dengan sifat yang lebih baik, dan pembuatan model penyakit. Ini adalah salah satu alat terpenting dalam biologi molekuler.
Metode Ekstensi Primer
Pendekatan paling umum menggunakan primer oligonukleotida mutagenik yang mengandung mutasi yang diinginkan, diapit oleh sekuens komplementer terhadap DNA target. Primer dianil ke templat untai tunggal, dan DNA polimerase memanjangkannya untuk menghasilkan molekul untai ganda yang lengkap. Untai asli berasal dari templat tipe liar, sementara untai yang baru disintesis membawa mutasi.
Seleksi terhadap untai parental diperlukan untuk memperkaya mutan. Dalam metode Kunkel klasik, templat ditumbuhkan dalam strain bakteri dut ung yang menggabungkan urasil sebagai pengganti timin. Setelah sintesis in vitro, templat yang mengandung urasil didegradasi oleh urasil-DNA glikosilase, meninggalkan untai mutan yang baru disintesis tetap utuh. Kit komersial menggunakan enzim restriksi DpnI, yang membelah DNA termetilasi, untuk mencerna templat yang berasal dari bakteri sambil meninggalkan untai yang mengandung mutasi yang disintesis in vitro.
Mutagenesis Berbasis PCR
Ekstensi tumpang tindih PCR menggunakan dua putaran amplifikasi. Pada putaran pertama, dua reaksi PCR terpisah mengamplifikasi fragmen yang tumpang tindih dari gen target. Satu pasangan primer termasuk mutasi, dan ujung fragmen tumpang tindih di situs mutasi. Pada putaran kedua, dua fragmen dicampur dan digunakan sebagai templat untuk PCR dengan primer luar, menghasilkan produk panjang penuh yang mengandung mutasi. Metode ini memerlukan desain primer yang cermat tetapi sangat efisien dan tidak memerlukan templat untai tunggal.
Mutagenesis seluruh plasmid menggunakan sepasang primer mutagenik komplementer pada templat plasmid untai ganda. DNA polimerase dengan ketelitian tinggi mengamplifikasi seluruh plasmid dalam reaksi PCR, dan templat termetilasi dicerna dengan DpnI. Reaksi ditransformasi ke E. coli, di mana DNA sirkular yang bertakik diperbaiki. Metode ini sederhana dan banyak digunakan untuk memperkenalkan mutasi titik, insersi, dan delesi.
Aplikasi dalam Rekayasa Protein
Mutagenesis terarah situs memungkinkan investigasi sistematis hubungan struktur-fungsi protein. Pemindaian alanin memutasikan setiap residu di daerah yang diminati menjadi alanin, menghilangkan rantai samping di luar karbon beta. Analisis protein mutan mengungkapkan residu mana yang penting untuk fungsi. Pendekatan ini telah digunakan untuk memetakan situs aktif enzim, mengidentifikasi residu pengikat ligan, dan menentukan kontribusi asam amino individu terhadap stabilitas protein.
Mutagenesis kaset menggantikan segmen pendek gen dengan kaset oligonukleotida sintetis yang mengandung sekuens acak. Mutagenesis saturasi memperkenalkan semua kemungkinan substitusi asam amino pada posisi yang dipilih, menciptakan pustaka yang dapat disaring untuk fungsi yang lebih baik. Evolusi terarah menggabungkan mutagenesis acak dengan seleksi atau penyaringan untuk menghasilkan protein dengan sifat yang ditingkatkan, seperti termostabilitas yang lebih tinggi, spesifisitas substrat yang diubah, atau aktivitas katalitik yang lebih baik.
Pemodelan Penyakit
Mutagenesis terarah situs digunakan untuk membuat model hewan dari penyakit genetik manusia. Sistem CRISPR-Cas9 telah sangat mempercepat proses ini, memungkinkan pengenalan mutasi spesifik ke dalam genom tikus, mencit, zebrafish, dan organisme lain. Model ini merekapitulasi fenotip penyakit manusia dan digunakan untuk mempelajari mekanisme penyakit dan menguji terapi potensial. Mutasi titik yang sesuai dengan yang ditemukan pada pasien dapat diperkenalkan untuk mempelajari korelasi genotip-fenotip.
Keterbatasan
Mutagenesis terarah situs dapat menghasilkan hasil yang tidak terduga. Mutasi yang dimaksud dapat memengaruhi lipatan protein daripada fungsi spesifik yang sedang dipelajari. Mutasi dapat mengganggu struktur lokal dengan cara yang tidak terduga, dan interpretasi fenotip mutan harus mempertimbangkan efek tidak langsung. Eksperimen kontrol, seperti mengekspresikan protein mutan pada tingkat tipe liar dan mengonfirmasi pelipatan yang tepat melalui dikroisme sirkular atau metode lain, sangat penting untuk interpretasi yang ketat.
Mutagenesis Kaset dan Sintesis Gen
Sintesis gen modern memungkinkan produksi sekuens DNA khusus dengan biaya yang menurun, memungkinkan generasi mutan dalam jumlah besar tanpa metode berbasis PCR. Gen sintetis dapat dirancang dengan kodon yang dioptimalkan, situs restriksi yang diperkenalkan, dan beberapa mutasi. Pustaka kombinatorial dapat dihasilkan dengan merakit oligonukleotida sintetis. Pendekatan ini semakin menggantikan mutagenesis terarah situs tradisional untuk aplikasi yang memerlukan banyak varian, seperti merekayasa antibodi atau mengoptimalkan jalur metabolisme.
